以本地早橘和槾橘為母本倍性雜交創制柑橘三倍體

解凱東，彭珺，袁東亞，強瑞瑞，謝善鵬，周銳，夏強明，伍小萌，柯甫志，劉高平，GROSSER Jude W，郭文武

以本地早橘和槾橘為母本倍性雜交創制柑橘三倍體

解凱東1，彭珺1，袁東亞1，強瑞瑞1，謝善鵬1，周銳1，夏強明1，伍小萌1，柯甫志2，劉高平3，GROSSER Jude W4，郭文武1

（1華中農業大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，中國武漢 430070；2浙江省農業科學院柑桔研究所，中國浙江臺州 318020；3浙江省臺州市黃巖區果樹技術推廣總站，中國浙江臺州 318020；4美國佛羅里達大學柑橘研究與教育中心，美國佛羅里達 33850）

【】基于二倍體與四倍體倍性雜交策略創制柑橘三倍體新種質。以二倍體為母本，四倍體為父本進行人工授粉，授粉后85 d采摘幼果并對未成熟種子實施幼胚離體挽救培養；再生植株后，用流式細胞儀和根尖染色體計數法對再生植株進行倍性鑒定；并用SSR標記對三倍體后代進行分子鑒定。以本地早橘和槾橘為母本，8個異源四倍體體細胞雜種和1個雙二倍體為父本，配置9個倍性雜交組合，共授粉2 749朵花，坐果489個，平均坐果率17.8%；培養幼嫩種子2 239粒，經幼胚離體挽救培養，共再生植株260株；用流式細胞儀和根尖染色體計數檢測再生植株倍性，獲得三倍體141株；SSR分子鑒定表明從槾橘×NS組合隨機選取的50株三倍體后代全部為雙親的有性后代；三倍體后代在溫室生長一年后，采用嫁接（枳砧）將這些三倍體定植于田間。這些三倍體新種質為本地早橘和槾橘無核新品種培育奠定了寶貴的材料基礎。

柑橘；無核育種；三倍體；幼胚離體挽救培養；流式細胞儀

0 引言

【研究意義】柑橘是世界第一大水果，也是我國南方栽培面積最廣、經濟地位最重要的果樹，在鄉村振興和精準扶貧方面發揮著重要作用[1]。我國柑橘主要供應鮮果市場，無核果實由于食用方便、品質佳，愈發受消費者青睞[2-3]。雖然我國柑橘地方品種繁多，但多數有核，難以滿足當今市場對無核優質果實的消費需求。因此，果實無核化是解決我國特色柑橘無核品種匱乏和提升地方品種商品價值的重要手段。【前人研究進展】本地早橘和槾橘均原產我國，本地早橘為早熟品種，味甜少酸，汁多化渣；槾橘是一個品質較優的晚熟鮮食品種。兩者在浙江均有百年以上栽培歷史，曾是當地大力發展的主栽品種。但由于其種子較多和長期無性繁殖引起的種性衰退，兩者果實品質嚴重下降。特別是國外一些無核品種的引進和種植，對本地早橘和槾橘的沖擊較大，導致其栽培面積大范圍縮減[4]。三倍體雌雄配子敗育，是天然的不育類型，且其不育性狀不受環境影響，是培育無核柑橘的重要手段[5]。柑橘中，二倍體為母本，與四倍體為父本的倍性雜交是培育三倍體最經典的策略[6]。基于該策略，美國、意大利、西班牙、日本和中國等國的科研工作者培育出了大量柑橘三倍體，并成功選育出一批表現優良的無核新品種[2-3,7-12]。【本研究切入點】近年來，柑橘細胞工程育種技術（包括體細胞雜交和同源四倍體快速發掘技術）飛速發展，新獲得了大批柑橘異源四倍體體細胞雜種和同源四倍體[7,13-15]，為柑橘倍性雜交創制無核三倍體提供了優良的育種親本。異源四倍體體細胞雜種包含兩個融合親本的全部遺傳物質，綜合了其雙親優良性狀，如體細胞雜種‘Succari甜橙+Page橘柚’果實風味佳，少核且早熟[16]，以其為父本倍性雜交創制的三倍體后代可能兼具3個親本的優良性狀，遺傳變異豐富，有利于篩選果實品質性狀優良且無核的柑橘新品種。【擬解決的關鍵問題】本研究以浙江黃巖地方品種本地早橘和槾橘為母本，與8個柑橘異源四倍體體細胞雜種和1個雙二倍體為父本倍性雜交，結合幼胚離體挽救培養和流式細胞儀倍性分析，創制一批具有豐富遺傳變異的三倍體植株，為我國柑橘無核新品種培育奠定寶貴的材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2014—2018年，以柑橘單胚性品種—槾橘（Hort. ex Tan）和單、多胚混合型品種—本地早橘（Hort. ex Tanaka）為母本，異源四倍體體細胞雜種NS（Blanco ×Macf. +L. Osbeck）[7]、SP（L. Osbeck +Blanco ×Macf.）[7]、MD（Blanco ×L. Osbeck +Blanco）[16]、SM（L. Osbeck +Blanco ×L. Osbeck）[7]、PL（Blanco ×Macf. +Blanco）[16]、PM（Blanco ×Macf. +Blanco ×L. Osbeck）[16]、VP（L. Osbeck +Blanco ×Macf.）[17]、PCS（Blanco ×Macf. +Hort. ex Tanaka ×）[16]和Succari甜橙（L. Osbeck）雙二倍體（4x Suc）為父本，配置9個倍性雜交組合。所有四倍體花粉均采自華中農業大學柑橘研究所種質資源圃。本地早橘授粉地點為華中農業大學柑橘研究所種質資源圃；槾橘授粉地點為浙江省農業科學院柑桔研究所試驗基地。

1.2 花粉制備及人工授粉

柑橘初花期，采摘四倍體父本即將開放的花帶回實驗室，用鑷子將花藥剝下后鋪于有濾紙的培養皿，并將其置于烘箱28℃烘1—2 d，待花粉完全干燥后，將其收集至離心管后置于-20℃冰箱保存備用。人工授粉在柑橘盛花期前進行，選取生長健壯、花量大的枝條進行標記，將已開花和小花蕾全部去掉，枝條上僅保留待授粉的花；用鑷子人工去雄后，用小毛筆蘸取少量父本花粉均勻涂于待授粉花的柱頭上。若授粉后8 h內下雨，需重新授粉一次。

1.3 幼胚離體挽救培養

幼胚離體挽救培養參考Xie等[12]的方法。采摘授粉后85 d的幼果帶回實驗室，無菌條件下將幼果浸泡于75%酒精消毒15 min，之后再置于酒精燈上燃燒消毒，酒精燃燒完后將果實剖開剝取出未成熟種子。為提高種子萌發率，將其種皮從合點端切開并向珠孔端輕輕撕至幼胚暴露，再將處理后的種子接種至萌發培養基（MT培養基+1 mg?L-1GA3）。光照培養室培養1個月后，將形成的胚狀體置于生芽培養基（MT + 0.5 mg?L-1BA + 0.5 mg?L-1KT + 0.1 mg?L-1NAA）中增殖生芽；待其長出2—3片葉后將莖切下，置于生根培養基（1/2 MT + 0.1 mg?L-1IBA + 0.5 mg?L-1NAA + 0.5 g?L-1活性炭）中誘導生根。培養條件：溫度：（25±1）℃；濕度：70%左右；光照強度：40 μmol?m-2?s-1；光照時間：16 h/天。

1.4 再生植株倍性分析

流式細胞儀（Sysmex，Japan）倍性分析參照解凱東等[2]的方法。以二倍體母本葉片為對照，取待測樣品0.5 cm2大小的葉片于塑料皿中，加入200 μL細胞裂解液（Precise-P，Sysmex），并用刀片將其充分切碎；加入800 μL DAPI染色液（Precise-P，Sysmex）后，用33 μm微孔濾膜將樣品過濾到2.5 mL試管并上機檢測。樣品倍性分析圖像由Flomax軟件（Sysmex，Japan）自動生成。

根尖染色體計數參考LAN等[18]的方法。取1.5 mm左右生長旺盛的根尖，用飽和對二氯苯20℃預處理2—4 h；0.075 mol?L-1KCl低滲處理30 min后，用新鮮的卡諾固定液（無水乙醇﹕冰乙酸 = 3﹕1）室溫下固定24 h，最后置于70%乙醇中4℃保存備用。制片前，將根尖用磷酸緩沖液清洗干凈，并置于2%纖維素酶 + 2%果膠酶（1﹕1）混合酶液中，37℃下處理1 h左右；酶解結束后，吸取1—2個根尖于干凈的載玻片上，滴1滴1%卡寶品紅染液染色1 min后蓋上蓋玻片，用鉛筆均勻敲打蓋玻片直至材料分散均勻，最后用Olympus DP70顯微鏡鏡檢并拍照。

1.5 植株移栽及嫁接

移栽前將植株置于試管中室溫下煉苗3—5 d，之后將其移入小塑料杯，待其成活后再移入大營養缽并置于溫室。苗期需加強管理，保證幼苗的正常生長。植株在溫室生長1年后，次年8月下旬取其木質化的枝條為接穗，以枳為砧木將其嫁接于田間（枳砧提前定植）。

1.6 SSR分子鑒定

基因組DNA提取參照CHENG等[19]的方法，DNA濃度和質量用NanoDrop 1000紫外分光光度計（Thermo Scientific，USA）檢測。DNA原液用TE緩沖液稀釋至約50 ng?μL-1。SSR引物（表1）由上海生工生物工程股份有限公司合成。SSR分析方法具體如下：PCR體系為10 μL：2×PCR反應mix（Vazyme）5 μL，正反向引物各0.1 μL，DNA模板1 μL，滅菌超純水3.8 μL。PCR反應在ProFlex PCR儀（ABI，USA）上進行，擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性60 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，32個循環；72℃延伸7 min；最后12℃保存。擴增完成后，PCR產物在恒定電壓95 V條件下，用2.5% Metaphor瓊脂糖凝膠（Lonza，USA）電泳約1 h后用凝膠成像系統（BIO-RAD，USA）拍照。

表1 3對SSR引物序列

2 結果

2.1 授粉、胚搶救及植株再生

以二倍體槾橘和本地早橘為母本，8個異源四倍體體細胞雜種和1個雙二倍體為父本，配置了9個倍性雜交組合（表2）。其中，以槾橘為母本，NS為父本配置了1個組合；以本地早橘為母本，7個異源四倍體（MD、SM、SP、PL、PM、VP、PCS）及雙二倍體4x Suc為父本，配置8個雜交組合。由表2可知，9個雜交組合共授粉2 749朵花，坐果489個，平均坐果率17.8%。其中以本地早橘為母本的組合坐果率較低，介于10.3%—26.4%；而槾橘×NS坐果率較高，為42.9%。9個組合共離體培養未成熟種子2 239粒，其中以槾橘為母本培養種子267粒，以本地早橘為母本培養種子1 972粒。經幼胚離體挽救培養，9個組合共再生植株260株，平均植株再生率11.6%；其中，以本地早橘為母本的8個組合再生植株181株，植株再生率介于3.2%—37.1%；槾橘×NS組合再生植株79株，植株再生率29.6%。幼胚離體挽救培養、植株再生及田間嫁接過程見圖1。

表2 以本地早橘和槾橘為母本的倍性雜交組合及植株再生

a：授粉后85 d的種子（下）及對照種子（上）；b：接種于萌發培養基的種子；c：種子萌發形成胚狀體；d：生芽培養；e：生根培養；f：植株煉苗；g：移入小塑料杯的三倍體；h：移入溫室的三倍體群體；i：嫁接至田間的三倍體植株（枳砧）

2.2 再生植株倍性分析

用流式細胞儀對所有再生植株進行倍性分析（圖2），表明以單胚性槾橘為母本再生的79棵植株，經檢測全部為三倍體（表2），三倍體獲得率100%。以單、多胚混合型本地早橘為母本的8個雜交組合再生的181棵植株，經檢測三倍體有62株（表2），三倍體獲得率34.3%。此外，從‘槾橘×NS’組合隨機挑選3株三倍體用于根尖染色體計數分析，表明三倍體染色體均為27條，驗證了流式細胞儀倍性檢測的準確性。上述多倍體在溫室生長一年后，已全部嫁接于田間。

2.3 三倍體后代的分子鑒定

用3對SSR引物對‘槾橘×NS’組合中隨機選取的50株三倍體后代進行分子鑒定，顯示50株三倍體后代均含有父母本特異條帶，表明所有檢測的三倍體后代均為雙親的有性后代（圖3）。

a：流式細胞儀倍性鑒定（PK1=50，二倍體；PK2=75，三倍體）；b、c：根尖染色體計數（b：二倍體，2n=2x=18；c：三倍體，2n=3x=27），標尺=5 μm

引物Mest88的擴增譜圖；M：槾橘；F：NS；1—50：三倍體后代 SSR profile of primer Mest88; M: Man tangerine; F: NS; 1-50: The triploid progenies

3 討論

柑橘是我國南方果樹主導產業之一，栽培歷史悠久，資源豐富，地方良種多；但我國目前規模化栽培的80余個柑橘品種，約一半引自國外[21]。特別是一些優質的無核品種，如溫州蜜柑、紐荷爾臍橙、倫晚臍橙、紅美人等，在我國柑橘產區大面積引種栽培，導致一些地方特色品種，如本地早橘和槾橘的栽培面積逐年縮減。果實有核和品質衰退可能是導致這些品種在市場上面臨淘汰的根本原因。柑橘長期無性繁殖容易感染并積累病毒，導致果實品質降低[22]，難以滿足消費者對品質提升的需求。與有核果實相比，無核果實食用方便，倍受消費者青睞。因此，采用合理的育種手段，實現果實無核和其他品質性狀的綜合改良（或提純復壯）是有效提升這些地方品種市場競爭力的重要保障。

與二倍體果樹相比，三倍體由于細胞核內染色體增加了一套，其形態和生理往往會有一些新的變化，通常表現為器官巨大、育性降低、新陳代謝旺盛和對環境適應性增強等。如三倍體梨新品種‘華幸’[23]、‘華香酥’[24]均表現為果大、品質優和抗黑心病等特點；三倍體枇杷‘華玉無核1號’果實無核，可溶性固形物含量高，豐產性好[25]。而柑橘三倍體除表現果實無核外，部分三倍體優系在抗逆性[26-27]、成熟期調控[28-29]和功能性成分代謝[30-31]及抗氧化活性[32]等方面也表現出優異的應用價值。就柑橘而言，由于多數品種單性結實能力強，不用擔心由于三倍體育性降低而導致坐果難的問題；而柑橘等果樹多數以無性繁殖為主，通過培育三倍體實現無核和其他優良性狀結合，一旦改良成功，即可長期持續利用。如西班牙為解決柑橘果實有核和市場周年供應等問題，采用倍性雜交培育三倍體的策略，成功培育出‘Sofar’‘Garbí’‘Alborea’和‘Albir’等幾個成熟期不同的三倍體新品種且大面積栽培，填補了西班牙柑橘鮮果市場1—3月份的空白[28-29,33]。美國科學家針對柚和葡萄柚含有呋喃香豆素的問題，以柚為母本，與葡萄柚同源四倍體（父本）倍性雜交，成功培育出一個呋喃香豆素含量很低，無核、果實風味好且無苦味的三倍體葡萄柚新品種，在美國已商業化種植[34]。因此，培育三倍體在柑橘遺傳改良中具有巨大的應用潛力。

本研究基于2x×4x倍性雜交策略，以本地早橘和槾橘為母本培育三倍體，是實現這兩個品種無核遺傳改良的有效方法。近20年來，雖然國內外在柑橘三倍體無核育種方面取得了一定進展，但針對本地早橘和槾橘有核性狀創制三倍體的報道較少；除美國外，國外多數國家倍性雜交主要以同源四倍體為父本[8-10]。本研究選用的四倍體父本大多數為2個優良二倍體品種經原生質體融合再生創制的異源四倍體體細胞雜種，與同源四倍體相比，異源四倍體體細胞雜種綜合了雙親的遺傳物質，以其為父本與本地早橘和槾橘倍性雜交獲得的三倍體后代不僅果實無核，而且可能兼具3個優良二倍體親本的遺傳物質，遺傳變異豐富，有利于培育無核且其他性狀（如高糖、極早熟、易剝皮等）優良的柑橘新品種。

前期研究發現，以本地早橘為母本倍性雜交，其坐果率和植株再生率均較低[3]，但以其為母本創制的三倍體后代果實不僅無核，且部分株系果實表現出極易剝皮或與親本相比成熟期提前等優點（武漢地區9月中旬果實已轉色，數據未發表），表明本地早橘在培育柑橘極早熟和易剝皮品種方面是一個優良的二倍體育種親本。因此，為獲得一定數量的具有豐富遺傳變異的本地早橘三倍體后代，本研究以其為母本配置了8個雜交組合，這8個組合坐果率（10.3%—26.4%）、植株再生率（3.19%—37.14%）確實較低，與筆者前期結果一致，可能與本地早橘品種特性有關。與本地早橘相比，以槾橘為母本不僅坐果率高，且易再生三倍體；但槾橘在本研究中是第一次用作親本創制三倍體，其三倍體后代果實性狀表現如何正在評價中；若田間反饋信息表明其為較好的育種親本，未來將以其為親本配置更多倍性雜交組合，用于柑橘無核三倍體新品種的培育。

4 結論

基于柑橘幼胚離體挽救培養和流式細胞儀快速倍性檢測技術，從9個倍性雜交組合共再生三倍體141株，分子鑒定結果表明所有檢測的三倍體后代均為有性雜種，為本地早橘和槾橘無核遺傳改良奠定了寶貴的材料基礎。

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Production ofTriploids Based on Interploidy Crossing with Bendizao and Man Tangerines as Female Parents

XIE KaiDong1, PENG Jun1, YUAN DongYa1, QIANG RuiRui1, XIE ShanPeng1, ZHOU Rui1, XIA QiangMing1, WU XiaoMeng1, KE FuZhi2, LIU GaoPing3, GROSSER Jude W4, GUO WenWu1

(1College of Horticulture & Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (Ministry of Education), Wuhan 430070, China;2Citrus Research Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Taizhou 318020, Zhejiang, China;3Huangyan Fruit Tree Technology Promotion General Station, Taizhou 318020, Zhejiang, China;4Citrus Research and Education Center, IFAS, University of Florida, Lake Alfred FL 33850, USA)

【】The aim of this study was to create the citrus triploids based on diploid and tetraploid ploidy cross strategy.【】The artificial pollination was conducted with diploid as female parent and tetraploid as male parent. Young fruits were sampled at 85 d after pollination (DAP) and immature seeds were extracted and subjected toembryo rescue. Following plantlet regeneration from the embryos, their ploidy level was determined by flow cytometry and root-tip chromosome counting, as well as the genetic origin determined using simple sequence repeat (SSR) markers. 【】A total of nine interploidy crosses were carried out by using Bendizao tangerine and Man tangerine as female parents and eight allotetraploid somatic hybrids and one doubled diploids as male parents. From all crosses, 2 749 flowers were pollinated and 489 fruits were set, with an average fruit setting rate of 17.8%. By conductingimmature embryo rescue, totally 260 plants were regenerated from 2 239 seeds cultured. By determining their ploidy level using flow cytometry and root-tip chromosome counting, 141 seedlings were proven to be triploids. SSR analysis showed that all of 50 randomly selected triploid plants from Man tangerine × NS were the hybrids of their both parents. After one year growing in greenhouse, all triploids were grafted ontoin the field to accelerate flowering. 【】These triploid citrus plants obtained herein provided elite materials for potential seedless variety selection.

; seedless breeding; polyploid; embryo rescue; flow cytometry

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.020

2020-09-01；

2020-10-14

國家自然科學基金國際合作重點項目（31820103011）、湖北省科技支撐計劃（2020BBA036）、廣東省科技計劃（2018B020202009）、中央高校基本科研業務費專項資金（2662019QD048，2662018PY007）

解凱東，Tel：027-87287393；E-mail：xiekaidong@mail.hzau.edu.cn。通信作者郭文武，E-mail：guoww@mail.hzau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）