干擾KISS1基因對豬卵巢顆粒細胞功能的影響

陸思羽，何穎婷，周小楓，辛曉萍，張愛玲，袁曉龍，張哲，李加琪

干擾KISS1基因對豬卵巢顆粒細胞功能的影響

陸思羽1，何穎婷1，周小楓1，辛曉萍1，張愛玲2，袁曉龍1，張哲1，李加琪1

（1廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室/國家生豬種業工程技術研究中心/華南農業大學動物科學學院，廣州 510642；2廣東高校應用生態工程技術開發中心/廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣州 510310）

卵泡是卵巢的基本結構和功能單位，其主要功能是排卵和分泌激素。顆粒細胞能促進卵泡發育，其過度凋亡能抑制卵泡發育，誘導卵泡閉鎖，進而降低雌性動物發情頻率，影響雌性動物繁殖力。現已有研究發現，在卵巢組織中發揮著重要作用。【】研究通過干擾，以闡釋對豬卵巢顆粒細胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影響，為完善在豬顆粒細胞中的分子調控機制提供一定的依據。設計的干擾片段KISS1-siRNA，轉染體外培養的母豬卵巢顆粒細胞，通過實時定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）檢測干擾對母豬卵巢顆粒細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信號通路部分基因轉錄水平的影響；采用流式檢測法、Annexin V- FITC及ELISA技術，分別探究干擾對顆粒細胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E2）分泌量的影響，最后使用qRT-PCR技術檢測對雌激素受體及雌激素信號通路關鍵基因轉錄水平的影響。在豬顆粒細胞內，干擾后，PI3K通路激活相關基因、、及轉錄水平下降，其中關鍵基因的轉錄水平顯著降低（＜0.05），PI3K通路激活抑制相關基因、及轉錄水平也有所降低；干擾后，顆粒細胞周期在細胞分裂間期（G0/ G1）阻斷，細胞的凋亡率顯著上升，細胞中E2的濃度顯著降低（＜0.01），雌激素受體和及雌激素通路的基因、、、和轉錄水平也相應顯著下降（＜0.05）。能夠參與豬顆粒細胞PI3K和雌激素通路，干擾能夠使卵巢顆粒細胞阻滯在細胞分裂間期，促進顆粒細胞凋亡，降低顆粒細胞分泌雌激素的能力，表明對于卵巢顆粒細胞的分裂與生長、雌激素分泌具有重要作用。

母豬；顆粒細胞；；PI3K；E2

0 引言

【研究意義】卵巢是母畜繁育的基礎，其主要功能是產生和排出成熟的卵子。卵巢卵泡中的顆粒細胞能夠分泌性激素，促進母畜性征的發育及維持，卵巢能否健康發育關系著母畜繁殖能力的強弱及利用年限的長短[1]。卵泡生長發育的本質是顆粒細胞增殖和分化[2]，卵泡閉鎖的主要標志是顆粒細胞凋亡，顆粒細胞能夠為卵巢和卵泡的生長發育提供促性腺激素受體、類固醇激素、細胞因子、生長因子等物質[3]，顆粒細胞過度凋亡會導致雌激素分泌減少，孕激素分泌增加[4]等。綜上所述，顆粒細胞作為卵泡的重要組成部分，其功能會直接影響卵泡的生長發育，進而影響雌性動物的繁殖能力。本研究將顆粒細胞作為探究卵泡體外發育的細胞模型，通過設計的干擾片段，基于實時定量PCR（quantitative real time PCR, qRT- PCR）試驗證明干擾能夠影響PI3K/AKT通路的信號傳導，并進一步在細胞水平和分子水平探究了干擾對豬卵巢顆粒細胞凋亡、周期及雌激素分泌能力的影響，為完善調控顆粒細胞功能的機制研究提供了一定的理論基礎。【前人研究進展】1997年Lee通過原位雜交和差異顯示技術首次發現并命名了，該基因位于人類1號染色體1q32-41區，能夠抑制腫瘤生長[5]，因此可作為區分轉移性黑色素瘤和非轉移性黑色素瘤的標志物[6]。近年來有研究表明，基因在母畜發情、卵泡生長發育、排卵等生理過程中起著重要的作用[7]。對成年大鼠使用Kisspeptin治療后，的表達量與大鼠的排卵數成正相關[8-9]，而突變，會導致大鼠和小鼠的卵巢功能衰退，卵泡發育異常，進而阻礙卵泡成熟，影響小鼠卵巢黃體組織的形成[9-10]。此外，當小鼠到達初情期時，和在下丘腦-垂體-性腺軸中的表達量顯著增高，表明信號可由性腺軸傳導，在哺乳動物中樞和神經內分泌系統中發揮作用[8]。這些研究結果表明，在一定程度上影響著母畜的繁殖性能。前期研究已經證實過表達能夠促進卵巢卵泡的發育和排卵[8]，且在卵泡生長發育的過程中起到重要性作用[7]，但目前干擾在豬卵泡顆粒細胞中的作用尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）可以磷酸化磷脂酰肌醇[11]，其作為細胞中典型的信號轉導通路[12-13]，參與調節細胞的生長、分化、增殖和凋亡。PI3K/AKT是調控原始卵泡激活和發育的經典信號通路，是PI3K/AKT通路的終止信號，在初級和次級卵泡中敲除卵母細胞的該基因，PI3K/AKT信號通路仍能夠正常激活[14]，敲除成年小鼠卵母細胞中的，小鼠的原始卵泡在卵泡池就會發生早衰，且FSH和LH分泌異常，使小鼠喪失生育能力[15]，但是敲除顆粒細胞中的，能夠減緩顆粒細胞凋亡[16]，并促進顆粒細胞增殖。此外蔡競等證實等表達水平下調能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性，抑制顆粒細胞增殖，進而影響卵泡發育[17]，綜上可知卵巢卵泡的發育與PI3K/AKT通路活性相關。【本研究切入點】PI3K信號通路與卵巢卵泡的生長發育密切相關，筆者前期研究表明過表達能夠顯著降低豬卵巢顆粒細胞的凋亡率，促進顆粒細胞分泌雌二醇（estradiol, E2），顯著上調PI3K信號通路關鍵基因及雌激素受體和的mRNA水平[18]，基于干擾豬卵巢顆粒細胞中基因的表達，能夠影響PI3K信號通路部分標志基因的表達，我們推測干擾同樣也能夠影響顆粒細胞功能，因此本研究擬通過干擾，進一步闡釋對豬卵巢顆粒細胞功能的影響機制。【擬解決的關鍵問題】本研究以長大二元雜母豬卵巢卵泡顆粒細胞為試驗材料，在轉錄水平證實干擾能夠影響PI3K信號通路相關基因的表達，并擬在細胞和分子水平研究干擾對顆粒細胞凋亡、周期及E2分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

母豬卵巢顆粒細胞：采集廣州市嘉禾望崗屠宰場的長大二元雜母豬卵巢，迅速置于4℃含2%雙抗（青霉素和鏈霉素）的PBS中，盡快返回實驗室，并迅速分離卵巢顆粒細胞。

主要試劑：DMEM基礎培養基、含EDTA的胰酶稀釋液、PBS緩沖液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自Hyclone（美國）；Lipofectamine?3000轉染試劑盒、Opti-MEM?試劑購自Invitrogen（美國）；的干擾片段KISS1-siRNA（CAACAAGAAGTGGGA GCAGAA）及對照Scrambled- siRNA由廣州銳博生物科技有限公司（中國）合成；Trizol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒購自TAKARA（日本）；無水乙醇、4%甲醛、氯仿、異丙醇購自廣州鼎國生物有限公司（中國）；SYBR Green qPCR Mix購自Thermo（美國）；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司（中國）；豬雌二醇試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司（中國）；其他均為常規化學試劑。

1.2 原代顆粒細胞的分離與培養

從屠宰場采集的母豬卵巢，迅速置于4℃含2%雙抗（青霉素和鏈霉素）的PBS試劑中，迅速帶回實驗室，在準備室用PBS清洗數次。在細胞房超凈臺取5 mL DMEM于15 mL離心管，使用鑷子夾取母豬卵巢，用1 mL注射器小心多次吸取卵泡液共2 mL于15 mL離心管（卵泡直徑為3—5 mm）；25℃ 800 r/min離心5 min，棄上清，再加入預熱的PBS（含1%雙抗），輕柔吹打以重懸沉淀細胞，清洗沉淀細胞兩次。先加入10 mL完全培養基（含10%小牛血清和1%雙抗）于75 cm2細胞培養瓶，再加入5 mL細胞懸液，輕柔搖晃均勻。將培養瓶置于37℃，5% CO2培養箱，48 h后觀察顆粒細胞的生長狀況，用PBS清洗顆粒細胞兩次，加入15 mL的完全培養基，再培養24 h可進行后續相關試驗。

1.3 顆粒細胞的接種和轉染

鋪板：觀察細胞狀態，當細胞匯合度達到80%左右，用預熱的PBS（含1%雙抗）清洗顆粒細胞兩次；使用5 mL 0.25%的胰蛋白酶消化75 cm2培養瓶中的細胞3—5 min，快速加入5 mL不完全培養基（含10%胎牛血清的DMEM培養液）終止消化，25℃ 800 r/min離心5 min；用預熱的PBS（含1%雙抗）清洗細胞兩次。將細胞懸液均勻加入細胞培養孔中，用完全培養基補充體積，輕柔地搖晃均勻，置于37℃，5% CO2培養箱繼續培養。

轉染：鋪板后細胞的匯合度達到80%左右，即可轉染。用預熱的PBS清洗顆粒細胞兩次，轉染方法參照Lipofectamine? 3000試劑盒說明書（每個試驗組設計4個重復，使用24孔細胞培養板進行），步驟如下：在滅菌的1.5 mL離心管中加100 μL Opti-MEM和4 μL Lipofectamine? 3000試劑，離心混勻；在新的離心管中依次加入95 μL Opti-MEM、5 μL稀釋好的Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA（此時干擾片段及其對照終濃度為50 nmol·L-1）及4 μL P3000TM，離心混勻；將Lipofectamine? 3000混合液加到P3000TM混合液中，離心混勻，在室溫下孵育10 min；在每孔細胞中加入450 μL不完全培養基及50 μL混合液；轉染后將細胞培養板置于37℃，5% CO2培養箱繼續培養，6—12 h后換液（防止轉染試劑對細胞影響過大）。

1.4 顆粒細胞RNA抽提

從細胞中抽提RNA，不需要對細胞進行消化，直接加入Trizol（10 cm2·mL-1）在冰上放置10—15 min，4℃12 000 r/min離心5 min，將含RNA的上清轉移至新的RNase-free管，加入氯仿（氯仿﹕Trizol為 1﹕5），激烈震蕩，室溫下放置5 min，4℃12 000 r/min離心15 min，將上層水相小心移至新的RNase- free管，加入異丙醇（異丙醇﹕Trizol為1﹕2），輕微顛倒混勻，室溫下放置10 min，4℃12 000 r/min離心15 min，去上清。加入與Trizol等量的75%乙醇，清洗抽提的RNA，4℃12 000 r/min離心15 min，去上清，此步驟重復兩次。將RNA于室溫干燥5—10 min，加入30 μL的DEPC水溶解RNA沉淀。

RNA質檢：制備濃度為1%的瓊脂糖凝膠，將2 μL RNA樣品與2 μL Loading Buffer混勻，15 V/cm電壓電泳20 min，使用凝膠成像儀拍照，觀察條帶，使用紫外分光光度計檢測樣品OD260/OD280的比值；-80℃保存備用。

1.5 檢測關鍵基因的轉錄水平

RNA反轉錄參照TAKARA的PrimerScriptTMRT Reagent Kit說明書。RNA反轉錄反應體系（10 μL）：5×PrimeScriptRT Master Mix，2 μL；Total RNA≤500 ng；補充RNase Free dH2O至總體積達10 μL。RNA反轉錄反應條件：37℃15 min，85℃5 s。

參照NCBI公布的序列信息，使用Primer primer 5.0設計qRT-PCR引物（表1）。以母豬卵巢顆粒細胞的cDNA為模板，GAPDH為內參。qPCR反應體系（20 μL）：2×SYBR Green PCR Master Mix，10 μL；PCR Forward Primer，0.6 μmol·L-1；PCR Reverse Primer，0.6 μmol·L-1；cDNA，2 μL；補充dd H2O至總體積達20 μL。qPCR反應程序：95℃預變性10 min；95℃預變性5 s，60℃延伸1 min，42個循環。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

表1 定量引物

1.6 顆粒細胞凋亡檢測

參照江蘇凱基生物技術股份有限公司的Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行顆粒細胞凋亡檢測。取細胞接種于6孔板，當細胞匯合度達到80%左右，轉染Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA于顆粒細胞培養24 h，PBS清洗細胞，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，再次用PBS溶液清洗細胞。取0.5 mL 細胞懸液（約5×105個細胞），加入500 μL 1×Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入室溫預熱的5 μL Propidium Iodide，室溫避光孵育5 min，立即用流式細胞儀檢測分析（每個試驗組設計3個重復）。

1.7 顆粒細胞周期檢測

使用江蘇凱基生物技術股份有限公司的流式檢測細胞周期試劑盒，取細胞接種于6孔細胞板，當細胞匯合度達到80%左右，轉染Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA于顆粒細胞培養24 h，PBS清洗細胞，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，再次用PBS溶液清洗細胞。使用70%的乙醇溶液固定細胞，4℃固定細胞4 h以上，將固定好的顆粒細胞用預冷的PBS洗兩次，室溫2 000 r/min離心5 min，用400 μL的碘化丙啶輕柔重懸細胞，加入100 μL RNase，4℃避光孵育30 min。24 h內用流式細胞儀檢測分析（每個試驗組設計3個重復）。

1.8 顆粒細胞上清中E2含量檢測

使用ELISA檢測細胞上清中E2的含量，參照江蘇酶免實業有限公司的豬雌二醇ELISA試劑盒說明書。確定標準品孔和樣本孔，在標準品孔中加不同濃度的標準品50 μL；取細胞接種于6孔板，當細胞匯合度達到80%左右，轉染Scrambled-siRNA和KISS1- siRNA于顆粒細胞培養24 h，吸取細胞上清1 000 r/min離心20 min，取50 μL于96孔板即為樣本孔，空白孔不加；用封板膜封住反應孔，37℃孵育30 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，每孔加入350 μL的洗滌液，靜置1 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，該步驟重復5次；每孔加入100 μL的辣根過氧化物酶標記的檢測抗體（除空白孔），用封板膜封住反應孔，37℃孵育30 min，棄去液體，在吸水紙上拍干；每孔加入350 μL的洗滌液，室溫靜置1 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，該步驟重復5次；每孔加入各50 μL A和B底物，用錫箔紙包裹以避光，37℃孵育15 min；每孔加入50 μL的終止液，在15 min內用酶標儀A450測定OD值。

1.9 數據的統計分析

每個試驗3—4個生物學重復，數據均用平均值±標準差表示，并經雙尾T-test檢驗差異是否具有統計學意義。**代表＜0.01，*代表＜0.05。

2 結果

2.1 干擾豬KISS1的效果

轉染Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA（序列：CAACAAGAAGTGGGAGCAGAA）至顆粒細胞后的qRT-PCR結果如圖1，KISS1-siRNA組的的表達水平顯著低于Scrambled-siRNA對照組（＜0.01），結果表明干擾片段KISS1-siRNA具有良好的干擾效果，可以用于后續試驗。

* P＜0.05，** P＜0.01。下同 The same as below

2.2 干擾KISS1抑制PI3K信號通路

干擾后，激活PI3K信號通路的轉錄水平顯著降低（＜0.05），轉錄水平降低，但差異不顯著（圖2-A）；抑制PI3K通路的和轉錄水平顯著降低（＜0.05），的mRNA表達水平降低，但差異不顯著（圖2-B）。結果表明，干擾能夠抑制PI3K信號通路部分標志基因的表達。

A. PI3K信號通路激活相關基因的表達；B. PI3K信號通路抑制相關基因的表達

2.3 干擾KISS1的表達促進顆粒細胞的凋亡

顆粒細胞Annexin FITC/PI檢測結果如圖3，其中Q1區域為機械損傷細胞，Q2（FITC+/PI+）區域為晚期凋亡或壞死細胞，Q3（FITC+/PI-）區域為早期凋亡細胞，Q4（FITC-/PI-）區域為活細胞（圖3-A和B）。KISS1-siRNA組顆粒細胞的凋亡率顯著高于Scrambled- siRNA對照組（＜0.01）（圖3-C），結果表明，干擾促進顆粒細胞凋亡。

A.轉染KISS1-siRNA的流式檢測結果；B.轉染Scrambled-siRNA的流式檢測結果；C.干擾KISS1促進顆粒細胞凋亡

2.4 干擾KISS1的表達影響顆粒細胞的細胞周期

為探究對顆粒細胞周期的影響，流式檢測結果如圖4，單因素方差分析證實KISS1-siRNA組處于G1/G0期的顆粒細胞比例顯著高于Scrambled- siRNA對照組的顆粒細胞（＜0.01），即干擾后，顆粒細胞阻滯在分裂間期。

2.5 干擾KISS1的表達抑制顆粒細胞分泌E2

顆粒細胞的主要功能之一是分泌E2，為研究對顆粒細胞分泌E2能力的影響，ELISA法檢測結果如圖5，KISS1-siRNA組細胞上清中E2的濃度顯著低于Scrambled-siRNA對照組（＜0.01），即干擾的表達，可以抑制顆粒細胞分泌E2。

圖4 干擾KISS1能夠將顆粒細胞阻滯在分裂間期

2.6 干擾KISS1的表達能影響雌激素信號通路相關基因的表達

干擾能夠影響顆粒細胞的凋亡和周期，并影響顆粒細胞分泌E2的能力，為進一步探究能否影響雌激素合成相關基因及雌激素受體的轉錄水平，qRT-PCR結果證實，干擾，雌激素受體的轉錄水平顯著低于Scrambled-siRNA組（＜0.05），的轉錄水平低于Scrambled-siRNA組，差異不顯著（圖6-A），說明干擾能夠抑制和表達。此外，qRT-PCR結果證實，干擾后，雌激素合成通路基因（＜0.05）、（＜0.01）、（＜0.05）和（＜0.05）轉錄水平顯著低于Scrambled-siRNA組，的轉錄水平低于Scrambled-siRNA組（圖6-B），說明干擾能夠影響雌激素合成通路基因轉錄水平。

圖5 干擾KISS1抑制顆粒細胞分泌E2

3 討論

3.1 KISS1與PI3K信號通路的聯系

豬的位于9號染色體[19]，包含2個外顯子，CDS區長度約為417 bp，編碼138個氨基酸[20]，廣泛分布于人和動物的各個組織中，在人的胎盤中表達量最高[6, 21]，在大鼠的下丘腦中表達量最高[22]，在豬的下丘腦、垂體、卵巢等組織中都有不同水平的表達[20]。早期有關的研究主要集中在癌細胞的轉移抑制[23]，之后的研究更多集中在對哺乳動物中樞調節和神經內分泌的作用[24]，近期已有研究證實，在哺乳動物的卵巢中表達，但關于在豬卵巢中表達調控機制的研究較少。此外，PI3K/AKT信號通路是調控原始卵泡激活和發育的經典信號通路，于是本研究首先探究了干擾對PI3K信號通路中部分基因轉錄水平的影響。又因為卵泡是卵巢的組成單位，圓形泡狀卵泡位于卵巢皮質部，主要由卵母細胞、顆粒細胞和膜細胞組成，根據卵母細胞及顆粒細胞不同時期的生長狀況，可將卵泡分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡及成熟卵泡。原始卵泡的卵母細胞僅包裹著單層扁平狀的顆粒細胞，隨著卵泡的發育，包裹卵母細胞的顆粒細胞逐漸增至數層，形態也由扁平狀變為柱狀，并在卵泡排卵前逐漸分化為包裹卵母細胞的卵丘顆粒細胞和緊貼卵泡內壁的壁層顆粒細胞[25-27]。顆粒細胞的發育優先于卵母細胞的發育[28]，因而顆粒細胞的生長分化是原始卵泡生長和啟動的關鍵因素，而顆粒細胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要標志，于是本研究將母豬卵巢顆粒細胞作為探究卵泡體外發育的細胞模型。干擾后，發現能夠激活PI3K信號通路的轉錄水平顯著降低（＜0.05），抑制PI3K信號通路激活的轉錄水平也顯著降低（＜0.05），該結果初步說明干擾可能微調PI3K信號通路的基因轉錄水平，并影響PI3K信號通路活性。

A. 干擾KISS1抑制ESR1和ESR2表達；B. 干擾KISS1抑制雌激素通路基因的表達

3.2 KISS1與顆粒細胞功能的聯系

基于干擾能夠影響PI3K/AKT信號通路標志基因的表達量，于是進一步檢測干擾對顆粒細胞功能的影響。前期研究發現，過表達能夠促進顆粒細胞增殖，抑制顆粒細胞凋亡[18]；本研究發現，干擾，凋亡的顆粒細胞比例顯著增加，這部分結果與前期研究結果相呼應，證明的轉錄水平能夠影響顆粒細胞的增殖和凋亡，于是進一步研究干擾對顆粒細胞周期的影響。已知細胞周期分為G0/G1、S和G2/M期，其中G0/G1期為細胞處于阻留的狀態，細胞在未受刺激時會暫時停止分裂，但DNA合成與細胞分裂的潛力仍然存在，在一定適宜刺激下，又可進入周期進行分裂增殖[29]，G0/G1期阻滯是機體調節細胞周期的重要手段[30]。S期為DNA合成時期，DNA數目在此時期加倍，一般情況下細胞一旦進入S期，細胞分裂就會繼續進行下去，直到下一周期[31]。本研究發現干擾，阻滯在G0/G1期的顆粒細胞顯著高于對照組（＜0.01），而處于S期的顆粒細胞則低于對照組，但差異不顯著，細胞周期結合細胞凋亡的結果，也說明干擾能夠顯著影響顆粒細胞的功能。

3.3 KISS1與顆粒細胞E2分泌的聯系

信號傳導是下丘腦回路的一部分，該信號能夠促性腺激素釋放，進而促進卵巢中E2釋放[32]、性器官發育[33]等，于是本研究擬通過干擾，探究與顆粒細胞E2分泌的聯系，結果表明體外干擾顆粒細胞中的，培養基上清中E2的濃度顯著降低（＜0.01），該部分結果與前人研究結果一致。

同時已有研究表明，雌激素受體和在動物機體內具有重要的生理作用[34-35]，E2與受體和結合才能發揮作用[36]，且在卵巢發育的過程中，隨著顆粒細胞的生長，的表達水平也隨之增加[37-38]。當雌激素受體與其配體結合時，可協同PI3K通路，激活原始卵泡，促進卵泡成熟[39]，但當小鼠體內的雌激素受體缺失時，小鼠血清中FSH、LH、E2等含量顯著高于正常小鼠，小鼠排卵功能發生障礙[40]。綜上所述，和基因的轉錄水平，能夠反映顆粒細胞分泌E2的能力。此外，雌激素受體的表達除了可以調節相關激素的分泌，還能夠升高雌激素合成相關基因和的轉錄水平，促進排卵[41]。于是本研究將Scrambled-siRNA和KISS1-siRNA轉染至顆粒細胞，抽取細胞RNA，并使用qRT-PCR分析顆粒細胞中雌激素受體及E2信號通路關鍵基因的轉錄水平。結果證實，干擾，E2受體表達量顯著下調，E2信號通路關鍵基因、、和也顯著下調，該結果與ELISA結果一致，從分子水平佐證了干擾能夠抑制顆粒細胞E2分泌。

4 結論

干擾能夠抑制豬卵巢顆粒細胞中PI3K信號通路的激活，同時能夠促進顆粒細胞的凋亡，將顆粒細胞阻滯于分裂間期。干擾能夠抑制顆粒細胞中雌激素受體和及雌激素合成信號通路基因、、和的轉錄水平，抑制E2的分泌。

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Effect ofInterference on the Function of Porcine Granulosa Cells in Porcine Ovary

Lu SiYu1, HE YingTing1, Zhou XiaoFeng1, Xin XiaoPing1, Zhang AiLing2, Yuan XiaoLong1, ZHANG Zhe1, Li JiaQi1

（1Guangdong Provincial Key Laboratory of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding/National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry/College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642；2Guangdong Development Center of Applied Ecology and Ecological Engineering in Universities/Biology and Food Engineering Institute,Guangdong University of Education,Guangzhou 510310）

【】As the basic structural and functional unit of ovary, the main functions of follicles are ovulation and hormone secretion. Granulosa cells proliferation can promote the development of follicles, while the excessive apoptosis of granulosa cells will inhibit the development of follicles, induce follicular atresia, reduce the estrus frequency and affect the reproductive capacity of female animals. Recent studies have found that theplays an important role in ovary. 【】This study was aimed to explore the effects ofon apoptosis, cell cycle and estrogen secretion of porcine granulosa cells, through interfering the expression of, so as to provide some useful information in molecular regulation mechanism ofon porcine granulosa cells. 【】To investigate the effect of knockdownon the transcription of key genes on phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway in porcine granulosa cells, KISS1-siRNA were designed and transfected to porcine granulosa cells, and then quantitative real time PCR (qRT PCR) was applied to detect the transcription ofThen, flow cytometry, Annexin V-FITC, and ELISA were utilized to explore the effects of KISS1-siRNA on granulosa cell cycle, apoptosis, and secretion of E2, respectively. Finally, qRT-PCR was applied to explore the effects of KISS1-siRNA on estrogen receptor and estrogen signaling pathway. 【】 In porcine granulosa cells, interferinggene could significantly decrease the transcription of(＜0.05), while,anddecreased with no significant difference (＞0.05). The mRNA levels of the genes, involving in activation of PI3K signaling pathway like,andwere also decreased with no significant difference (＞0.05). Transfecting KISS1-siRNA to porcine granulosa cells could significantly promote cell apoptosis (＜0.01), arrest cell cycle at G0/G1 phase (＜0.01), and decrease the E2secretion (＜0.01). After knockdown, the transcription of estrogen receptorand, as well as,,,andof estrogen pathway were also decreased significantly (＜0.05). 【】 This study confirmed thatgene could participate in PI3K and estrogen signaling pathways. Interferingcould promote porcine granulosa cells apoptosis, arrest cell cycle at G0/G1 phase (＜0.01), and decrease the E2secretion. It suggested thatplayed an important role in the division, growth and estrogen secretion of porcine granulosa cells.

sows; granulosa cells;; PI3K; E2

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.018

2019-11-28；

2020-10-29

國家生豬現代農業產業技術體系（CARS-35）、國家自然科學基金青年項目（31902131）、廣東省自然科學基金面上項目（2019A1515010676）、廣東省揚帆計劃（2014YT02H042）、廣東省普通高校青年創新人才項目（2018KQNCX019）、廣州市科技計劃項目（201707010001）

陸思羽，E-mail：siyu_lu19@163.com。通信作者李加琪，E-mail：jqli@scau.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）