液質聯用方法研究伊馬替尼藥代動力學及生物等效性綜述

李宏霞，段小群，李婷

（1.桂林醫學院，廣西 桂林；2.桂林醫學院附屬醫院，廣西 桂林）

0 引言

伊馬替尼（Imatinib）是一種酪氨酸激酶抑制劑，可以特異性地作用于BCR-ABL 酪氨酸激酶，是CML 的一線治療藥物，也可用于胃腸道基質瘤（GIST ）的治療。

甲磺酸伊馬替尼，化學名：4-[（4- 甲基-1- 哌嗪）甲基]-N-[4- 甲基-3-[[4-（3- 吡啶）-2- 嘧啶] 氨基] 苯基]苯甲酰胺甲磺酸鹽。分子式與分子量：C29H31N7O·CH4SO3；589.7。甲磺酸伊馬替尼原料藥為白色至淡黃色結晶性粉末；無臭；本品在水中易溶，在甲醇中溶解，在異丙醇中幾乎不溶，在0.1mol/L 的鹽酸溶液中易溶；pH4.5-6.0；本品的熔點為220～226℃[1]。

1 色譜條件及質譜條件

現今液質聯用廣泛用于測定血漿中藥物濃度，考慮其具有高效分離、高選擇性、高靈敏性，故用來伊馬替尼定量分析。文獻報道中主要常用的LC-MS/MS 儀器來源有Agilent、Waters、AB Sciex、SHIMADZU。

圖1 甲磺酸伊馬替尼化學結構式

表1、表2 是本綜述總結的相關研究中液質聯用的主要信息。通過整合以下文獻中的信息可初步確定主要的液相條件和質譜條件。質譜條件：MRM,ESI+，離子對大致是494 →394。 液 相 條 件：色 譜 柱，ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm,3.5μm)；流動相B，乙腈，流動相A：0.1%甲酸&5mM 乙酸銨水溶液；流速1.0 mL-min-1；柱溫40℃。

表1 研究中的質譜條件

2 標準品和內標

從可追溯的來源獲得標準品。標準品應帶有分析證書（Certificate of Analysis)包括純度，儲存條件、失效日期和批號等。LC-MS/MS 生物分析要使用內標應盡可能使用穩定同位素標記的內標。在最近幾年的文獻中多采用氘代化合物作為內標。因此推薦采用伊馬替尼-D8 作為內標。

3 采樣點的選擇

表2 研究中的色譜條件

甲磺酸伊馬替尼在空腹給藥后大約2-4h 內達到血漿峰濃度，食物對吸收影響的研究顯示，與空腹時比較，高脂飲食后伊馬替尼吸收率輕微降低（Cmax 減少11%，tmax 延后1.5h）[2]。考慮高脂餐的影響，伊馬替尼可在清淡飲食后給藥。

根據《化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則》（2005）要求，一個完整的血藥濃度-時間曲線，應包括藥物各時相的采血點，即采樣點應包括給藥后的吸收相，峰濃度附近和消除相。一般在吸收相至少需要2～3 個采血點，峰濃度附近至少需要3 個采血點，消除相至少需要3～5 個采血點，總共一般不少于11～12 個采血點。根據《以藥動學參數為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術指導原則》（2016），建議每個周期采樣12～18 個采血點，采樣時間不短于3 個消除半衰期。

伊馬替尼的消除半衰期約為18 h，取樣時間點可以以伊馬替尼原型藥物半衰期計算，以3～5 個半衰期為宜[5]。伊馬替尼空腹給藥后大約2-4h 內達到血漿峰濃度，餐后給藥延后約1.5h，宜在給藥2～5.5h 密集采點。

根據其文獻報道伊馬替尼給藥后72h 血藥濃度仍在可測標曲范圍內，因此采樣結束時間宜設置在給藥后72h。綜合以上藥代動力學參數及查閱參考文獻可設計采血點如下：每周期于給藥前（0h，服藥前1.0h 內）和給藥后0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h、6.0h、7.0h、8.0h、12.0h、24.0h、36h、48h、72h，共20 個時間點采集靜脈血約4mL。

根據原研產品數據，伊馬替尼的消除半衰期約為18 h，其活性代謝產物半衰期約為40h，七天內約可排泄所給藥物劑量的81%，為避免前一周期的攜帶效應，清洗期宜為設為10～14d。

4 前處理及進樣分析

在目前報道的前處理方法中蛋白沉淀法是LC-MS 最常使用的方法之一，其中又最常用有機溶劑沉淀法，可使結合型的藥物釋放，減少乳化，保護儀器性能。甲醇和乙腈是最常用的沉淀劑，其中乙腈的沉淀更致密，沉淀更完全。推薦沉淀劑體積比例：含藥物的血漿與甲醇的體積比大于1：3，含藥物的血漿與乙腈的體積比大于1：2。推薦離心轉速：大于10000rpm/min。

前處理中的溶劑體系盡量與流動相保持一致，變換不同的有機試劑進行以及不同的蛋白沉淀比例，進行前處理；采用相應的有機試劑作為流動相進樣分析，確定藥物是否從結合物中釋放，以及化合物峰分離以及響應情況，推斷是否測定出藥物總濃度；由基質響應確定是否通過前處理將樣品純化、富集并消除基質干擾。

5 標準曲線范圍

定量下限是標準曲線的最低點，是能夠被可靠定量的樣本中伊馬替尼的最低濃度，具有可接受的準確度和精密度，應適用于預期的濃度和試驗目的。標準曲線濃度范圍應盡量覆蓋預期濃度范圍。如果臨床試驗單次給藥藥量為100mg，則可將標曲范圍初步定為5～1500 ng·mL-1。

在根據實際給藥總量和參考表3 及其他相關研究后確定標曲范圍，然后進行驗證，具體的按照《中國藥典》2015年版第四部附錄9012《生物樣本定量分析方法驗證指導原則》中的要求進行確證。

6 數據處理

現在的藥代動力學/生物等效性研究中主要將數據通過WinNonLin 等進行藥代動力學參數計算。如Cmax/ng·L-1、t1/2/h、tmax/h、AUC0-72h/ng·h·L-1、AUC0-∞/ng·h·L-1。

由非房室模型計算各受試者的藥代參數。同時用Excel計算各參數的算術均數、標準差、變異系數、中位數、最小值、最大值和幾何均數。主要藥代參數（Cmax、AUC）經對數轉換后進行方差分析（ANOVA），計算兩藥主要藥代參數的幾何平均值比值的90%置信區間，并進行等效性比較，等效區間設定為80.00%～125.00%。

表3 研究中的標曲范圍

7 總結

通過以上文獻等其他資料，可獲得目前伊馬替尼的母離子質荷比、主要子離子質荷比、極性、離子化方式、分子式、結構式、溶解度等詳細信息，進行方法開發。可利用針泵進樣，通過MRM 優化化合物參數，或手動優化，選擇合適的MS 方法；通過LC-MRM，進行色譜條件優化，選擇合適的LC-MS方法；最后選擇合理的前處理方法進行樣品配制。

初步確定方法后，進行方法學驗證，驗證項目：選擇性、標準曲線、定量下限、精密度、準確度、提取回收率、基質效應、穩定性、系統殘留和稀釋可靠性。

臨床試驗采樣點的確定主要考慮藥物達峰時間和藥物半衰期，也需要考慮食物的影響。將通過合理的臨床試驗采樣后的血樣前處理后進樣分析，最后將數據通過Excel、WinNonLin 等進行處理。最后獲得藥物的藥代動力學特征，判定藥物的生物等效性。

8 討論

一個合理的藥代動力學/生物等效性試驗或實驗方案的設計，主要包括采樣計劃和生物分析計劃，是在大量的文獻資料的基礎上，綜合考慮臨床、實驗室、藥物、儀器等相關因素后建立的。其中伊馬替尼的血藥濃度檢測雖有大量的研究文獻支持，但不同的試驗或實驗對象、不同基礎、不同的地點、不同的儀器等的變化，仍然需要具體問題具體分析，方法學驗證也應根據具體情況進行全部驗證或部分驗證。