兒茶素/殼聚糖復合膜的抗氧化性分析

郭梅英，佘 亮，夏彩芬

(湖北工程學院 化學與材料科學學院，湖北 孝感 432000)

殼聚糖(CS)是一種具有聚陽離子弱堿性質的多糖，是由甲殼素在強堿條件下，脫去乙酰基制備而來[1]。CS主要來源于蝦、蟹類動物外殼，是純天然可再生、對生物體無害的生物質資源，因其具有抗菌抑菌性、無毒性、生物相容性和成膜性等優良性能，在生物醫藥、食品保鮮和化妝品等領域得到廣泛的應用[2-3]。但CS的抗氧化性能一般，使得CS復合膜在面膜材料方面的發展受到一定的阻礙。在CS中加入聚乙烯醇(PVA)作交聯劑可制得具有一定機械強度的CS復合膜，該復合膜是目前護膚面膜的主要材料之一。

兒茶素又稱兒茶酸，主要來源于茶葉之中，其屬于黃烷醇類化合物，是茶多酚類物質的主要成分。兒茶素類物質根據碳環的結構類型不同，可分為以下4種結構：表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)[4-5]。兒茶素的分子鏈上含有很多活性酚羥基，能與人體中因為新陳代謝而產生的自由基反應，使自由基失去氧化性而穩定下來，防止自由基氧化人體組織器官和細胞使其失去原有的功能，因此兒茶素的抗氧化性很強，被廣泛應用于生物醫藥領域中[6]。兒茶素的提取方法主要有4種，分別是溶液浸提法、超聲波提取法、微波提取法和酶提取法。實驗室常用的方法是溶液浸提法，這種方法操作簡單，成本低廉，但提取到的兒茶素純度不高，易被氧化，后期還需多次除雜提純。雖然兒茶素被廣泛應用于醫藥保健和食品保鮮領域，但是它在護膚面膜方面的研究卻較為少見。

在當今社會，隨著人們生活水平和美容護膚意識的不斷提高，人們對自身皮膚的護理和保養意識越來越強。面膜作為美容護膚營養物質的一種載體，通過直接覆蓋到皮膚上將面膜中的營養物質作用于皮膚，起到補水保濕、美白的效果而深受人們的喜愛[7]。近年來，受到環境惡化和電磁輻射的影響，皮膚老化速度加快，人們對面膜的要求不斷提高，具備抗氧化性、抗衰老功能的面膜越來越具有市場競爭力。

本研究把不同質量的兒茶素添加到CS復合膜中，分析復合膜的吸濕透濕性和消除活性自由基的效果，探究兒茶素應用到面膜材料中的可行性，為兒茶素廣泛應用于護膚面膜領域提供參考。

1 實驗步驟

1.1 材料與儀器

主要實驗藥品：殼聚糖(低粘度)，分析純，上海瑞水生物有限公司；聚乙烯醇(PVA)，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；兒茶素，純度>98%，大連美侖生物技術有限公司；雙氧水，純度 ≥ 36%，國藥集團化學試劑有限公司；結晶紫，分析純；國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀，分析純，天津市東麗區泰蘭德化學試劑廠；DPPH，純度>97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；焦性沒食之酸，分析純，天津博迪化工股份有限公司。

主要實驗儀器：SQP電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；DF-101S磁力攪拌器，河南予華儀器設備有限公司；SHZ-D循環水多用真空泵，鞏義市科華儀器設備有限公司；DZF-6050真空干燥器，上海索普儀器有限公司；JSM-6510掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-5013型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 PVA/CS鑄膜液的優化

將PVA/CS總質量控制在2 g，分別按照不同質量分數的PVA(5%、10%、15%、20%、25%)稱取不同量的PVA和CS，用 50 mL的去離子水，在磁力攪拌器下的85 ℃恒溫油浴中，溶解PVA。用100 mL的1%冰醋酸溶液，采用同種方法，在55 ℃恒溫油浴中磁力攪拌2 h，溶解CS，且冷卻CS溶液后用3層紗布過濾，從而保證除去其中不溶性雜質。隨后，將配置好的不同比例的PVA、CS溶液共混，再放入55 ℃的恒溫磁力攪拌器中油浴1 h。

分別取上述不同質量比的混合液25 mL平鋪到有機玻璃模具中，以流延法使其流至整個底部，放置在真空干燥箱中脫去鑄膜液中的氣泡，脫后再放置于35 ℃烘箱中烘烤8 h，待其成膜后從模具上將其揭下，放在干燥通風的環境晾干，之后再放入掃描電鏡中，觀察PVA/CS膜的表面形貌，判斷二者的相容性，選擇最合適的配比，進行下一步試驗。

1.3 兒茶素/CS復合膜的制備

根據上述步驟選出PVA/CS鑄膜溶液的最佳配比，在PVA/CS最佳配比的鑄膜溶液中添加不同比例的兒茶素，其質量分數依次為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，兒茶素/CS混合溶液依次命名為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5，將所得不同比例的兒茶素/CS混合溶液放入35 ℃的磁力攪拌器中攪拌0.5 h，量取25 mL的混合液，注入10 cm×10 cm有機玻璃模具中，將其鋪平，涂抹均勻，真空脫泡后置于35 ℃的真空干燥箱內烘10 h。

1.4 復合膜表面結構分析

將復合膜剪成適合大小的條狀，用導電膠固定在樣品盤上，再將其置于噴金儀中噴金，噴金后置于掃描電鏡中，觀察樣品的表面形貌特征，分析復合膜的分散效果。

1.5 吸濕性分析

將兒茶素/CS復合膜裁成20 mm×20 mm的樣條，稱量樣條的初始質量M1，在室內溫度為15 ℃的條件下，在兩個干燥器底部放入無水氯化鈣，再分別放入氯化鎂和氯化鉀飽和鹽溶液，維持干燥器的相對濕度(RH)分別為33%和85%，將樣條置于兩個相對濕度不同的干燥器中，放置0.5 d、1 d、1.5 d、2 d、2.5 d，稱量各個時間段樣條的質量M2，用公式(1)計算復合膜吸濕率(%)[8]。

(1)

1.6 透濕性分析

水蒸氣的透過率及透濕性也是面膜材料的一個重要指標，對復合膜進行透濕性測試，選擇5個形狀、大小和質量都相同的試劑瓶，在試劑瓶內放置三分之一厚度的無水氯化鈣，再在試劑瓶口均勻涂抹凡士林，將復合膜(20 mm×20 mm)緊貼在試劑瓶上將其密封，稱量試劑瓶的重量，然后置于相對濕度為70%、溫度為25 ℃的環境中，使膜兩側的蒸氣壓保持穩定，每隔1 h測量1次試劑瓶的重量，共記錄8組數據[9]，用公式(2)計算水蒸氣透過率WVP(%)[10]。

(2)

式中：WVP為水蒸氣透過率(g/(d·m2))，△m為測試瓶質量的變化(g)，A為膜面積(m2)，t為時間(h)。

1.7 抗氧化性能分析

1.7.1 清除DPPH·的能力

配制pH 7.3的PBS緩沖溶液。準確稱取一定量的DPPH，加入80 mL無水乙醇，配成0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液。分別量取4 mL的pH 7.3的PBS和4 mL的0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液于10 mL的離心管中，將復合膜裁成35 mm×15 mm的樣條置于離心管中，25 ℃恒溫震蕩搖勻，在日光燈下反應0.5 h ，在紫外-可見光區的最大吸收波長處測量溶液的吸光度[11]。用公式(3)計算對DPPH·的清除率k(%)[12-13]：

(3)

式中：A0為純DPPH溶液的吸光度，A1為復合膜作用后的吸光度。

1.7.2 清除羥基自由基(·OH)的能力

吸取1 mL濃度為0.4 mmol/L的結晶紫溶液于10 mL的離心管中，先后分別加入5 mL的pH為7.3的PBS溶液、1 mL的1 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL的6%H2O2及裁好的35 mm×15 mm復合膜樣條，在25 ℃環境下恒溫震蕩30 min，使其充分反應，最后在紫外-可見光區的最大吸收波長處測定其溶液的吸光度，用蒸餾水做空白樣品作為對照，根據公式(4)計算清除率k(%)[14-15]：

(4)

式中：A為復合膜和·OH作用后的吸光度，A1為復合膜的吸光度，A2為蒸餾水的吸光度

量取50 mL Tris堿溶液和22.9 mL的0.1 mol/L HCl于100 mL容量瓶中，加入去離子水配制成100 mL的pH為8.2的Tris-HCl緩沖溶液，向10 mL的離心管中加入8 mL pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液和裁好的膜樣條(35 mm×15 mm)，在25 ℃下恒溫震蕩20 min，再加入0.1 mL45 mmol/L的焦性沒食子酸，迅速搖晃均勻溶液后倒入比色皿中，在最大吸收波長處測樣品溶液的吸光度A1，用蒸餾水作為空白試樣測吸光度A0，每隔30 s測1次，共測8組數據，分別做樣品溶液和對照溶液的吸光度隨時間變化的線性方程[16]，方程模式為A=kt+b，A為吸光度，k為自氧化速率，t為放置時間，對應的自氧化速率分別為和k1和k0,相關系數R2，根據公式(5)計算清除超氧陰離子的能力k(%)：

(5)

2 結果與分析

2.1 PVA/CS鑄膜液最佳配比的測定

將復合膜處理好后放入掃描電鏡中，放大1000倍，觀察其表面形貌，發現復合膜中PVA所占質量分數為15%時二者的相容性最好，因此選擇這樣配比的鑄膜液作為下面實驗的基底鑄膜液(PVA/CS復合膜SEM圖像未給出)。

2.2 兒茶素/CS復合膜表面形貌分析

將復合膜放入掃描電鏡中，在1000倍的狀態下，可以清楚地看到復合膜Q1、Q2、Q3、Q4、Q5的表面形貌，如圖1所示(不含截面圖)。

圖1 復合膜的SEM圖

由SEM圖像發現，空白試樣Q1表面比較平整，表面空隙較少，說明PVA和CS相容性較好，當分別加入質量分數為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的兒茶素后，復合膜Q2、Q3、Q4、Q5表面依舊非常平整，這說明兒茶素在復合膜中分散效果很好，且兒茶素的加入幾乎不影響復合膜的表面形貌。

2.3 吸濕性分析

兒茶素加入到CS溶液中，可以讓殼聚糖的親水基團和水分子形成氫鍵，大大提高了殼聚糖的吸濕性。圖2和圖3為兒茶素/CS復合膜在低濕度和高濕度下，吸濕性隨時間和兒茶素含量的變化圖，兒茶素的加入，有利于提高殼聚糖中親水基團的能力。由圖2可知，在相對濕度為33%時，樣品吸濕率大小為Q3>Q5>Q4>Q1>Q2，隨著樣品放置時間逐漸變長，復合膜總體的吸濕率是先提高后降低，由于加入的兒茶素含量較少，不同兒茶素比例的復合膜吸濕率變化幅度不是特別明顯，在60 h時，各樣品的吸濕率都逐漸靠近。其中的Q3在放置36 h時，吸濕率達到最高7.8%。即兒茶素質量分數為0.4%時，兒茶素/CS復合膜在低濕度下的吸濕性最好。

圖2 復合膜吸濕率隨時間的變化(RH 33%)

圖3 復合膜的吸濕率隨時間的變化(RH 85%)

由圖3可知，在相對濕度為85%，樣品吸濕率大小為Q4>Q5>Q2>Q3>Q1，在高濕度下復合膜的吸濕率逐漸增加，放置48 h時，Q4的吸濕率達到最大6.79%，且放置60 h后吸濕率變化不大。因此兒茶素質量分數為0.6%時，兒茶素/CS復合膜的吸濕率最佳。

2.4 透濕性分析

面膜中含有大量水分，但在使用過程中水分會被蒸發掉一部分，因此面膜材料應具有較低透濕率，才能使面膜能有效地鎖住水分，降低營養物質的流失，從而提高敷面效果。不同比例的兒茶素對復合膜的水蒸氣透過率如圖4所示。

圖4 復合膜隨時間變化的透濕率

從圖4中可以看出，空白試樣Q1的水蒸氣透過率最大，加入兒茶素之后，水蒸氣透過率顯著下降，Q2對水蒸氣阻隔效果最好，由此可知兒茶素加入到復合膜后能使復合膜的水蒸氣透過率顯著減小。水蒸氣透過率的大小為Q1>Q4>Q5>Q3>Q2，但是當兒茶素含量進一步增加時，水蒸氣透過率有微弱的上升趨勢，主要原因是隨著兒茶素量不斷增加，復合膜的緊密結構被破壞，分子間開始變得疏松，對水蒸氣的屏蔽作用變弱。因此兒茶素質量分數為0.2%時，兒茶素/CS復合膜的保濕效果最好。

2.5 抗氧化性能測定

自由基來源于人體各個部位正常新陳代謝，適量的自由基對人體不會有太大的危害，但當自由基過多時，就會加速細胞凋亡，誘導細胞癌變，引發一系列的疾病，因此人體需要攝入抗氧化劑來消除多余的自由基。自由基的種類主要有羥基自由基、含氮自由基和超氧自由基，用兒茶素/CS復合膜分別對這3種自由基進行抗氧化分析，分析不同質量分數的兒茶素/CS復合膜對自由基的清除效果。

2.5.1 清除DPPH·的能力

DPPH·是很穩定的一種經典含氮自由基，分析對DPPH·的消除能力可判斷兒茶素的抗氧化性強弱。不同質量分數的兒茶素對DPPH·的清除率見圖5。

圖5 不同質量分數的兒茶素對DPPH·的清除率

由圖5可知，加入兒茶素后復合膜對DPPH·的清除率顯著提高，其中Q5對DPPH·的清除率最大為77.78%，空白試樣Q1的消除率只有42.26%，當加入0.2%的兒茶素后，復合膜對DPPH·的清除率提高到75.6%。在被測濃度范圍內，當兒茶素的含量進一步增加時，復合膜的消除效果較為穩定。兒茶素/CS復合膜對DPPH·清除能力的強弱為Q5>Q3>Q4>Q2>Q1。這表明兒茶素的加入能有助于復合膜抵抗自由基引起的氧化作用，加入的兒茶素質量分數為0.8%時，兒茶素/CS復合膜對DPPH·的清除效果最好。

2.5.2 清除·OH的能力

·OH是含氧自由基中氧化活性最強的一種，因此檢測兒茶素/CS復合膜對清除·OH的能力是評價復合膜抗氧化性強弱的重要指標。不同質量分數的兒茶素對·OH的清除率見圖6。

圖6 不同質量分數的兒茶素對·OH的清除率

由圖6可知，隨著兒茶素的加入，復合膜對·OH的清除率先增加然后減小，復合膜對·OH清除率的大小順序為Q3>Q2>Q1>Q5>Q4，樣品Q3清除效果最好，為77.09%，即兒茶素的質量分數為0.4%時，對·OH的清除效果最好。在Q3之后，但隨著兒茶素的量進一步增加，清除率迅速下降。這表明低濃度的兒茶素對·OH有顯著的清除作用，一旦兒茶素的量過多，其對·OH的清除效果就會顯著下降。

表3 樣品清除率線性擬合關系

圖7 不同濃度的兒茶素對的清除率

3 結論

本文對不同質量分數的兒茶素加入到復合膜后的表面形貌、吸濕透濕性、抗氧化性進行了分析，發現加入兒茶素后不會破壞復合膜光滑平整的表面形貌，且在復合膜中的分散效果較好，增加加入的兒茶素的質量分數后復合膜的吸濕性逐漸增大，透濕性逐漸減小，表明兒茶素的加入增強了復合膜吸水和保濕的能力。