新疆南疆邊境地區(qū)優(yōu)勢蜱種及其基因多樣性分析

唐莉娟，劉 丹，卜三平

巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆庫爾勒 841000

蜱主要寄生于動物體表，可通過直接叮咬傳播疾病。據(jù)報道,世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了900多種蜱。目前我國共計121種硬蜱科,10種軟蜱科,但沒有納蜱。通過蜱蟲能夠傳播的病原體：病毒大約有126種、立克次體至少20種、原蟲和衣原體32種等。因此,加強對蜱傳疾病的相關(guān)研究是十分必要且刻不容緩的。

新疆是中國陸地邊境線最長的省份之一，南疆地區(qū)就與吉爾吉斯斯坦、巴基斯坦、塔吉克斯坦、阿富汗、印度五個國家接壤。新疆除了擁有經(jīng)濟地理位置的優(yōu)勢之外,還擁有這一廣袤地區(qū)獨特的地理景觀以及豐富多樣的物種。因此,其體表蜱種受復(fù)雜的地理景觀影響豐富而又獨特,同時這些蜱種也是蜱傳疾病的媒介生物。但新疆地區(qū)(尤其是南疆)關(guān)于蜱傳病毒、細菌和寄生蟲種類和分子流行情況等本底數(shù)據(jù)仍不清楚。實時監(jiān)測新疆南疆邊境地區(qū)蜱傳疾病有利于國際間傳染病“聯(lián)防聯(lián)控”數(shù)據(jù)的共享。

1 材料與方法

1.1 蜱的采集

201 9年3月～2020年6月,在新疆南疆皮山縣、葉城縣、烏什縣、烏恰縣、拜城縣5個縣市共采集家畜體表寄生蜱和游離蜱528只。將采集的蜱按采集時間和地點分類并且詳細標記蜱蟲的數(shù)量、蜱的狀態(tài)(死蜱、活蜱、飽血蜱以及非飽血蜱)和宿主。

1.2 蜱形態(tài)學(xué)鑒定分析

使用普通光學(xué)顯微鏡和體視解剖顯微鏡對采集到的蜱蟲進行形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定標準主要參照Walker主編的《寄生蜱鑒定指南》[1]和于心主編的《新疆蜱類志》[2]，

1.3 蜱種分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 引物設(shè)計：通過閱讀大量文獻以及本實驗室前期對蜱蟲的研究成果，最終決定參考文獻中的已知引物，委托上海祥音生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 PCR擴增：PCR總反應(yīng)體系25 μL：DNA模板1.5 μL，引物PF、PR各2 μL，10×PCR Buffer 2.4 μL，d NTP 2 μL，rTap酶0.6 μL，去離子水16.5 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,37個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。ddH2O為陰性對照,PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察檢測目的片段的大小。

2 結(jié)果

2.1 各縣市蜱數(shù)量以及蜱種構(gòu)成

本調(diào)查5個南疆縣市共采集528只蜱蟲，采樣結(jié)果顯示均為圖蘭扇頭蜱。

2.2 PCR擴增結(jié)果

16S rDNA、12S rDNA和COI基因片段由普通PCR擴增，蜱種擴增的片段分別在460 bp、400 bp和890 bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段的大小一致。

2.3 蜱線粒體基因擴增序列分析

比對擴增到的蜱線粒體基因序列，可以證實本次采集到的5個縣市的寄生蜱分子生物學(xué)分析與形態(tài)學(xué)方法鑒定結(jié)果一致,均為圖蘭扇頭蜱。

2.4 蜱種系統(tǒng)發(fā)育分析（見圖1）

圖1 基于16S rDNA基因蜱種系統(tǒng)進化樹分析

3 討論

蜱分為硬蜱科、軟蜱科和納蜱科三個科，截至目前為止，世界上蜱類有3科18屬約900種。其中，中國蜱類有2科10屬121種。一些學(xué)者主要調(diào)查分析了新疆各地區(qū)蜱類分布相關(guān)情況，所得結(jié)果有較高的參考價值。如王光雷等調(diào)查分析了1995年青河縣暴發(fā)的蜱傳疾病相關(guān)情況，結(jié)果表明此次蜱害的蜱種為草原革蜱；巴音查汗等對新疆和靜縣牦牛體表寄生的硬蜱進行了鑒定及分析，其優(yōu)勢蜱種主要包括銀盾革蜱、草原革蜱、小亞璃眼蜱、丹氏血蜱和微小牛蜱；2006年，阿不力克木·阿布都熱西提等對塔里木盆地蜱類的群落進行了分析研究，共采集獲得5屬10種蜱，其中只有拉合爾鈍緣蜱一種為軟蜱，其他均為硬蜱。然而，針對新疆南疆地區(qū)的蜱類調(diào)查至今缺乏比較全面系統(tǒng)的調(diào)查。本次采樣調(diào)查主要選擇了南疆地區(qū)的5個縣市,對南疆地區(qū)蜱蟲分布研究有著重要意義。

南疆地區(qū)自然植被的地點主要是平原植被稀疏，山地垂直帶明顯，不同環(huán)境形成不同植物群落。本次采集的蜱種分布的地理環(huán)境主要是荒漠半荒漠草原、荒漠沙丘、沙漠綠洲等，蜱種分布主要為圖蘭扇頭蜱,證實了前期學(xué)者關(guān)于圖蘭扇頭蜱是新疆優(yōu)勢蜱種的結(jié)論。通過序列比對結(jié)果顯示：本研究獲得圖蘭扇頭蜱線粒體16S rDNA基因片段與基因庫對應(yīng)的蜱種同源性可達99.02%～100%，該結(jié)果證實了新疆南疆地區(qū)家畜體表寄生的主要蜱種是圖蘭扇頭蜱。使用Mega 6.06軟件基于16S rDNA基因的NJ樹分析得知，本研究采集到的圖蘭扇頭蜱與阿克蘇、阿拉爾采集的圖蘭扇頭蜱處與同一分支，但各采樣采集到的圖蘭扇頭蜱16S rDNA基因序列有所差異，存在顯著的基因多樣性。本實驗對今后繼續(xù)開展南疆地區(qū)蜱傳病原及蜱種基因多樣性研究具有重要意義。