蔓越莓壓片糖果人體試食抑制大腸桿菌黏附的研究

李 芬，李愛民，，劉瀟瀟，吳曉磊，李子杰*

（1.江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.國珍健康科技（北京）有限公司，北京102206）

0 引言

尿路感染（UIT）作為一種高發性疾病，給醫療系統帶來沉重負擔［1］。UIT可引發尿毒癥、腎膿腫和急性腎損傷等疾病，具有急性發病率和死亡率的風險。UIT通常由多種細菌引起，其中尿路致病性大腸桿菌（UropathogenicEscerichia Coli，UPEC）是 主 要病 原體。UPEC感染會引發UIT，隨后通過尿道感染膀胱，甚至通過輸尿管到達腎臟，進而引發腎臟永久性的損傷［2］。治療尿路感染主要使用抗生素，如頭孢菌素［3］、氟喹諾酮類藥物［4］、氨基糖苷類藥物［5］和碳青霉烯類藥物［6］，雖然抗生素能夠在一定程度上治療尿路感染，但有副作用，包括產生耐藥性和減少有益的腸道微生物。因此，尋求其他非抗生素物質替代或減少抗生素在UIT治療中的使用具有重要意義。

蔓越莓廣泛種植于北美地區，在美容養顏和UIT、胃腸道、口腔、腫瘤、血管等相關疾病的預防和治療上具有顯著效果［7］。蔓越莓發揮作用的主要機理是其富含的原花青素可以改變UIT主要病原體UPEC對人尿道上皮細胞（HUC）黏附能力，使其難以附著在尿路和膀胱的細胞上并隨尿液被排出體外，從而實現UIT的預防和治療［8］。UPEC的菌毛分為P，F，1型［9］，其中P菌毛類型的UPEC是感染尿道上皮細胞的主要菌種［10］。藍娜娜等［11］通過體外實驗，發現蔓越莓提取物可以抑制UPEC對人尿道上皮細胞（HUC）的黏附；本研究在此基礎上，通過人體試吃實驗，探究蔓越莓壓片糖果對UPEC黏附HUC的影響，為蔓越莓相關產品的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人尿道上皮細胞（HUC），上海紀寧實業有限公司；尿道致病性P型大腸桿菌（UPEC），美國典型菌種保藏中心（ATCC700336）；蔓越莓壓片糖果，新時代健康產業（集團）有限公司；DMEM培養基，Gibco公司；胎牛血清和100×青鏈霉素混合液，Hyclone公司；Giemsa染色試劑盒和Hanks溶液，上海生工生物工程公司；4-二甲基氨基肉桂醛（HPLC純）和原花青素A2（HPLC純），Sigma公司；甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、乙酸（分析純）、鹽酸（分析純）以及丙酮（HPLC純），國藥集團有限公司。

1.2 儀器與設備

MOC-18AIC CO2培養箱，日本Panasonic公司；NU-425-400S二級生物安全柜，美國Nuaire公司，BA210酶標儀，美國Bio-rad公司；CT15RE離心機，日本HITACHI公司；Ts2-FL顯微鏡，日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 人體試吃蔓越莓壓片糖果方案

為了測定試食蔓越莓壓片糖果人員尿液對UPEC黏附HUC的影響，隨機抽選61名人員進行蔓越莓壓片糖果的試吃實驗，實驗人員一周內嚴禁食用含有原花青素的食物。首先在未服用蔓越莓壓片糖果前，試吃人員收集中段尿液約25 mL作為服藥前尿液樣品（0 h）。隨后服用8片蔓越莓壓片糖果，并在服用后2 h，4 h，8 h，12 h收集中段尿液25 mL作為服用后不同時間的樣品，樣品在4℃保存。

1.3.2 原花青素含量測定

采用4-（二甲氨基）肉桂醛（DMAC）法［12］測定樣品中原花青素的含量。吸取700μL不同濃度原花青素A2標準品（0 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L，25 mg/L）或700μL尿液上清樣品，加入到2.1 mL 0.1%DMAC試劑中，充分混勻后計時。分別吸取200μL到96孔板，室溫放置一定時間后用酶標儀在640 nm進行吸光度值測定，在讀取第一次吸光度之前至少要等待20 min，每5 min讀取一次數值（從20 min開始直至35～40 min），根據標準曲線計算尿液中原花青素的含量。

1.3.3 UPEC黏附HUC實驗

將服用前尿液樣品和服用后2 h，4 h，8 h，12 h尿液樣品4 000 g，離心10 min，取上清液900μL和100μL UPEC 37℃共培養30 min。將HUC消化稀釋至105個/mL和經過預處理的UPEC在37℃共培養1 h。孵育結束后，3 000 g離心3 min，沉淀物用Hanks溶液清洗兩次，清除未黏附的細菌后涂片，并用甲醇固定，使用Giemsa染液染色15 min，用無菌水沖洗未結合的染液，結合蓋玻片制片。在光學顯微鏡下計數HUC黏附UPEC的數目。其中服用前樣品（0 h）為對照組，服用后2 h，4 h，8 h，12 h為實驗組。采用Origin 8.0對數據進行t-檢驗統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣品中原花青素的含量

本研究檢測61名受試者服用蔓越莓壓片糖果后不同時間段（0 h，2 h，4 h，8 h，12 h）尿液中的原花青素含量。由于個體差異，每個受試者尿液中原花青素含量不同，服用前人體尿液中的原花青素質量濃度較低，平均為7.78 mg/L；而服用蔓越莓壓片糖果2～8 h后的處理組中，人體尿液中原花青素含量逐漸上升，服用后8 h樣本組中原花青素含量最高，平均值約為18.0 mg/L；12 h樣本組中原花青素質量濃度降低，約為9.45 mg/L。通過顯著性差異分析，結果如圖1所示：與服用蔓越莓壓片糖果前（0 h）比較，2 h，4 h，8 h后尿液中的原花青素含量都具有極顯著性差異，12 h后尿液中的原花青素含量不具有顯著性差異。

圖1 尿液中原花青素的濃度

2.2 人體試食蔓越莓壓片糖果對UPEC黏附HUC的影響

以1號和2號樣本組為例在顯微鏡觀察后進行說明，服用前的HUC細胞可黏附較多的UPEC，而服用蔓越莓壓片糖果2～8 h后的處理組中，單個尿道上皮細胞黏附的大腸桿菌數量遞減，12 h樣本組中尿道細胞黏附大腸桿菌數量增加（見圖2）。總體上來說，服用蔓越莓壓片糖果前的HUC可黏附較多的UPEC，平均可黏附44個；而服用蔓越莓壓片糖果2～8 h后的處理組中，單個HUC黏附的UPEC數量明顯遞減，2 h后平均可黏附35個UPEC，4 h后平均可黏附28個UPEC，8 h后平均可黏附17個UPEC。然而服用蔓越莓壓片糖果12 h后UPEC的個數明顯增加，平均可黏附37個UPEC。通過顯著性差異分析，如圖3所示：與服用蔓越莓壓片糖果前（0 h）比較，2 h，4 h，8 h后HUC黏附的UPEC數量減少，具有極顯著性差異，12 h后HUC黏附的UPEC數量減少具有顯著性差異，但同8 h相比HUC黏附的UPEC數量明顯增加。

圖2 人體試食蔓越莓壓片糖果對UPEC黏附HUC的影響

圖3 HUC上所黏附的UPEC數量統計

2.3 原花青素對UPEC的抗黏附作用的濃度-時間效應曲線

如上所述，蔓越莓壓片糖果中原花青素對UPEC黏附人尿道上皮細胞具有抑制作用。如圖4所示，與樣品中原花青素含量相對應，不同階段樣品處理過的UPEC對人尿道上皮細胞的黏附作用不同。隨著服用蔓越莓壓片糖果時間的增加，尿液中原花青素的含量逐漸升高，HUC黏附UPEC個數逐漸減少，8 h后原花青素的濃度最高，此時HUC黏附UPEC的個數最低。12 h后，尿液中原花青素的含量降低，同時HUC黏附UPEC個數增加，說明原花青素對UPEC的抗黏附作用具有濃度依賴性。

圖4 原花青素對UPEC的抗黏附作用的濃度-時間效應曲線

3 結語

尿路感染70%～90%是由尿路致病性大腸桿菌引起的，同時也是全世界最常見的感染類型之一，在世界范圍內造成巨大的經濟和醫療負擔。尋找預防和治療尿路感染的天然替代品引起科學家的廣泛關注。蔓越莓有多種酚類物質，其中原花青素能夠有效抑制P型菌毛大腸桿菌的黏附作用。本研究隨機選取61名志愿者，對志愿者服用蔓越莓壓片糖果尿液中的原花青素的含量進行定量，并建立蔓越莓原花青素對尿道致病性細菌的抗黏附作用的濃度-時間效應曲線。結果表明蔓越莓壓片糖果在體內吸收代謝后經腎排泄后仍有抗黏附效力，可用于預防和治療非復雜性尿路感染，從而為臨床上治療尿路感染提供科學依據。