噬菌體的生物學(xué)特性及其在畜禽健康中的應(yīng)用

（安徽省無為市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 無為 238300）

噬菌體（bacteriophage）是一類能夠感染細(xì)菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱，因部分種類能夠引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。噬菌體通常存在于充滿細(xì)菌群落的地方，如泥土、海水和動(dòng)物腸道中。一戰(zhàn)時(shí)期，英國科學(xué)家Twort和加拿大科學(xué)家d'Herelle[1]發(fā)現(xiàn)一些圓點(diǎn)能阻礙菌落生長，他們猜測其能夠抑制或殺死細(xì)菌，于是命名為噬菌體。隨后，越來越多的科學(xué)家分離并鑒定出了多種噬菌體。上世紀(jì)80年代以來，分子生物學(xué)快速發(fā)展，人類對噬菌體的研究發(fā)展到基因組分離、起源與進(jìn)化，以及噬菌體與宿主之間相互關(guān)系等多個(gè)領(lǐng)域。目前，關(guān)于噬菌體的研究已深入到對人類疾病的預(yù)防與治療，動(dòng)物腸道健康，食品、動(dòng)物產(chǎn)品及飼料中細(xì)菌的清除。本文就噬菌體的生物學(xué)特性進(jìn)行探討，同時(shí)綜述其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用，旨在為進(jìn)一步利用噬菌體提供方向。

1 生物學(xué)特性

1.1 命名與分類

按照病毒核酸類型可以將噬菌體分為群Ⅰ（雙股DNA 病毒，dsDNA）、群Ⅱ（單股 DNA 病毒，ssDNA）、群Ⅲ（雙股RNA病毒，dsRNA）和群Ⅳ（單股RNA病毒，ssRNA）；根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)可以分為dsDNA類（包括肌尾病毒科、長尾病毒科、短尾病毒科、古病毒科、紡錘病毒科、覆蓋病毒科、復(fù)層病毒科、脂毛病毒科和原體病毒科）、ssDNA類 （包括微小病毒科、絲狀病毒科）、dsRNA類（囊狀病毒科）和ssRNA類（光滑病毒科）；根據(jù)繁殖特性分為裂解性噬菌體（lytic）和溶原性噬菌體（lysogenic）[2]。

1.2 結(jié)構(gòu)組成

噬菌體因種類不同結(jié)構(gòu)也有差異，但是絕大多數(shù)噬菌體都是由核酸部分和外殼部分組成。核酸部分主要是單鏈DNA或RNA、雙鏈DNA或RNA其中的一種，外殼主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，它在與宿主菌表面受體結(jié)合中發(fā)揮作用，不同的噬菌體特異性主要由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定。無尾噬菌體的結(jié)構(gòu)為20面體的蛋白質(zhì)外殼（外表由規(guī)律排列的蛋白亞單位-衣殼組成）和包裹在內(nèi)部的核酸；有尾噬菌體結(jié)構(gòu)包括20面體的頭部、中空的針狀結(jié)構(gòu)及外鞘的尾部、尾絲和尾針組成的基部；線狀體噬菌體則呈現(xiàn)由殼粒組成的盤旋狀結(jié)構(gòu)。

1.3 理化特性與生存環(huán)境

噬菌體的蛋白質(zhì)外殼和核酸會(huì)受到溫度、pH值及化學(xué)試劑的影響而發(fā)生改變。不同噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白對溫度的敏感性存在一定差異。60℃10 min條件下，胎兒弧菌噬菌體 V-45（Campylobacter fetus）[3]完全失活，103 ℃嗜熱芽孢桿菌噬菌體（Bacillus alcalophilus）失活[4]，80 ℃大腸桿菌噬菌體 Bp6 失活[5]。同樣，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿一定程度上都會(huì)導(dǎo)致噬菌體失活。金黃色葡萄球菌噬菌體[6]在pH＜4或pH＞12條件下，或750 mL/L乙醇處理30 min后失活，而氯仿和DMSO對噬菌體的活性影響不大。耐藥肺炎克雷伯菌噬菌體JD902[7]在pH＜4或pH＞12條件下失活。豬鏈球菌噬菌體SMP在50℃10 min條件下失活，pH＜6或pH＞10效價(jià)下降，但是對氯仿不敏感[8]。因此，可以看出大部分噬菌體的適宜溫度和酸堿度趨于常溫呈pH中性，而對化學(xué)試劑不敏感。

1.4 作用機(jī)理

1.4.1 感染過程。噬菌體感染細(xì)菌的過程主要分兩類：一類是裂解性噬菌體，主要包括識(shí)別、吸附、注入核酸，復(fù)制病毒核酸，合成病毒其他物質(zhì)、裝配和釋放；另一類是溶原性噬菌體，主要包括識(shí)別、吸附、注入核酸，前噬菌體進(jìn)入宿主基因組，宿主細(xì)胞復(fù)制，環(huán)境誘導(dǎo)前噬菌體釋放，復(fù)制病毒核酸，合成病毒其他物質(zhì)、裝配和釋放。

通常情況下，有尾噬菌體基部的尾板中含有二氫葉酸還原酶及Zn2+[9]，這些物質(zhì)能夠與細(xì)菌的細(xì)胞壁、夾膜、菌毛或鞭毛上存在的特異性受體 （蛋白質(zhì)、多糖、脂多糖）特異性識(shí)別，并促發(fā)尾絲與細(xì)菌表面受體結(jié)合，從而吸附細(xì)菌。而后噬菌體尾管開通DNA通道，尾針接觸細(xì)菌肽聚糖，激活溶菌酶結(jié)構(gòu)，釋放溶菌酶水解肽聚糖，尾針穿透細(xì)菌內(nèi)膜，噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)菌。噬菌體DNA利用細(xì)菌RNA聚合酶合成自身mRNA，然后合成早期、中期和晚期蛋白。合成后噬菌體各部件有序裝配，分頭部裝配、尾部裝配、頭尾結(jié)合和尾絲裝配。最終裝配完成的噬菌體通過穿孔素-裂解酶系統(tǒng)（Holins-Lysin system）水解細(xì)菌肽聚糖層，裂解宿主菌，從而釋放子代噬菌體。

1.4.2 穿孔素-裂解酶系統(tǒng)（Holins-Lysin system）。穿孔素（Holins）是一種疏水性跨膜蛋白，主要功能是觸發(fā)細(xì)菌裂解反應(yīng)和形成跨膜通道，還具有體外裂菌功能。裂解酶（Lysin）是噬菌體在宿主細(xì)胞寄生的最后階段裂解細(xì)菌的一種酶，又稱為內(nèi)溶素或溶胞壁酶，主要功能為水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)。按裂解肽聚糖位點(diǎn)不同可以分為葡糖苷酶、酰胺酶、肽鏈內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)糖基酶[10]，其結(jié)構(gòu)主要由催化區(qū)和結(jié)合區(qū)構(gòu)成，并形成α螺旋和β轉(zhuǎn)角。

噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制子代噬菌體，并形成“穿孔素-裂解酶系統(tǒng)”，最終裂解細(xì)菌，釋放子代噬菌體。其過程為噬菌體的穿孔素和裂解酶基因在晚期利用宿主細(xì)菌合成穿孔素和裂解酶，穿孔素首先到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞膜，形成同源低聚物，在特定時(shí)間形成跨膜通道。之后裂解酶通過該通道被釋放至膜外破壞細(xì)胞壁，裂解宿主細(xì)胞，結(jié)束感染周期[11-13]。

但是在外界環(huán)境惡劣、不適應(yīng)釋放子代噬菌體條件下，噬菌體也會(huì)合成抗穿孔素，調(diào)控裂解過程，延長子代噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)的留存時(shí)間。其機(jī)理可能是噬菌體穿孔素基因存在于穿孔素和抗穿孔素雙序列，首先合成的抗穿孔素以某種構(gòu)相分布于細(xì)胞膜，穿孔素合成后優(yōu)先與抗穿孔素結(jié)合。當(dāng)外界條件允許時(shí)，膜發(fā)生去極化，抗穿孔素轉(zhuǎn)化成與穿孔素相同的膜分布構(gòu)象，并與穿孔素發(fā)揮相同的功能[8]。

2 在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用

2.1 防控細(xì)菌感染

自噬菌體被發(fā)現(xiàn)以來，人類一直探索用噬菌體替代抗生素防治動(dòng)物細(xì)菌感染。目前在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的噬菌體有大腸桿菌噬菌體、沙門氏菌噬菌體、空腸彎曲桿菌噬菌體、金黃色葡萄球菌噬菌體以及產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體等。Smith等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在家畜養(yǎng)殖中飼喂含有大腸桿菌噬菌體的飼料能夠明顯降低豬腹瀉；Albino等[15]研究表明，沙門氏菌噬菌體可以有效防止豬沙門氏菌感染；Varelaoritz[16]等確定金黃色葡萄球菌噬菌體可以治療奶牛乳腺炎。Wagenaar等[17]研究表明，在家禽養(yǎng)殖中，單獨(dú)或聯(lián)合使用噬菌體可以有效防控雞空腸彎曲桿菌；還有學(xué)者證實(shí)噬菌體可以替代抗生素用于治療因產(chǎn)氣莢膜梭菌導(dǎo)致的雞壞死性腸炎；Huff等[18]通過氣囊給藥證實(shí)，噬菌體在防控雞呼吸道感染大腸桿菌具有顯著療效。可以看出，噬菌體在防治畜禽常見疾病方面發(fā)揮出巨大作用。

2.2 改善腸道微生物菌群，調(diào)節(jié)機(jī)體健康

腸道是微生物聚集最豐富的場所之一，腸道內(nèi)含有大量的細(xì)菌、真菌和病毒，改善畜禽腸道健康能夠顯著提高畜禽的生產(chǎn)性能。例如，仔豬在生長發(fā)育期間極易因腹瀉導(dǎo)致死亡，家禽也容易因腸道疾病導(dǎo)致下痢和生長遲緩。利用噬菌體不僅能夠殺死畜禽腸道內(nèi)的有害細(xì)菌，而且能夠顯著調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群平衡，維持腸道健康。研究表明，早期的腸道干預(yù)能夠?qū)?dòng)物腸道菌群形成長期影響，同時(shí)還可以與腸道直接相互作用，通過直接穿越、感染細(xì)菌、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨噬細(xì)胞非特異性吞噬等形式穿過腸道上皮，進(jìn)入動(dòng)物血液、淋巴或內(nèi)臟[19]發(fā)揮殺菌作用。

3 噬菌體殺菌的局限性與開發(fā)前景

噬菌體雖然在抑制細(xì)菌、改善畜禽健康中發(fā)揮重要作用，但是也存在局限和不足。首先絕大多數(shù)噬菌體的特異性較強(qiáng)，宿主范圍窄，培養(yǎng)一種噬菌體往往只能抑制一種細(xì)菌，而且細(xì)菌還可能通過突變產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致噬菌體失效。如果利用多種噬菌體混合發(fā)揮效用，可能會(huì)導(dǎo)致研究成本增加。其次噬菌體與細(xì)菌是相伴相生的，細(xì)菌死亡后噬菌體也將裂解，其攜帶的某些毒素因子可能會(huì)釋放到畜禽體內(nèi)而危害畜禽健康[20]。噬菌體死亡后，其蛋白成分可能成為抗原，引起機(jī)體免疫應(yīng)答，清除這些異物會(huì)導(dǎo)致噬菌體的殺菌效果下降。

為了克服噬菌體的局限和不足，科學(xué)家們通過研究噬菌體作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)噬菌體發(fā)揮殺菌作用的主要過程是裂解酶水解細(xì)菌細(xì)胞壁，而大部分裂解酶本身對細(xì)菌的破壞遠(yuǎn)大于噬菌體，因此具有巨大的開發(fā)應(yīng)用潛力。相比較于噬菌體，裂解酶具有以下幾大優(yōu)勢：第一，裂解酶作用迅速高效，連續(xù)使用不會(huì)產(chǎn)生抗藥性[21]。第二，裂解酶的裂解譜較噬菌體廣，可以殺滅多種細(xì)菌，在殺菌和抑菌方面更具有優(yōu)越性。第三，裂解酶適宜的溫度和pH值與機(jī)體內(nèi)環(huán)境接近，規(guī)模化生產(chǎn)的制劑能夠高效、及時(shí)地發(fā)揮作用。因此，未來有可能研發(fā)出更多的裂解酶用于治療畜禽細(xì)菌感染，改善動(dòng)物健康。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，噬菌體作為一種天然的細(xì)菌病毒，越來越多地被應(yīng)用于防控畜禽細(xì)菌感染。但是由于其自身存在的局限性，可能逐漸被裂解酶所替代。而噬菌體與畜禽健康作用機(jī)理的的研究還不夠清楚，未來需要科學(xué)工作者更深入地研究噬菌體、細(xì)菌和機(jī)體的關(guān)系。