精準醫學時代肝細胞癌的系統治療

祝桂琦， 唐 政， 史穎弘， 樊 嘉

復旦大學附屬中山醫院 肝腫瘤外科， 上海 200030

1 精準醫學的概述

自2011年美國國立醫學院推出精準醫學(Precision Medicine)概念以來，如今精準醫學領域已變得炙手可熱。美國已于2015年啟動精準醫學計劃，我國也于2017年啟動精準醫學計劃[1]。精準醫學是在基于分子表型的疾病分類的基礎上，利用基因測序技術和生物醫學分析進行大樣本人群與特定疾病類型進行生物標志物的分析與鑒定、驗證與應用，從而尋找到病因和治療的靶點并對一種疾病不同狀態和過程進行分型，針對性的開發應用靶向特異性藥物，實現對于疾病和特定患者進行基于基因的個性化精準治療[2-3]。

2011年，美國國家科學院出版的TowardPrecisionMedicine:BuildingaKnowledgeNetworkforBiomedicalResearchandaNewTaxonomyofDisease提出，基因組學成果促進生物醫學信息學和臨床信息學的整合[4]，從而加速精準醫學時代的到來。多組學技術的快速發展和大規模平行測序的出現同時也為精確醫學的實施提供了強有力的技術支持[3]。精準醫學強調，通過強大的檢測手段和臨床特征的整合，可以將異質性疾病很好地分為更精確的亞型，從而使臨床醫生針對疾病亞型人群制訂更準確的診斷和治療策略，以最大限度地提高療效[5]。腫瘤領域一直是精確醫學的前沿，因惡性腫瘤不同的遺傳背景和驅動突變，腫瘤導致的死亡在世界范圍內都是患者死亡的主要原因之一。肝細胞癌(HCC，以下簡稱肝癌)是一種異質性很高的惡性腫瘤，其發病率和死亡率在世界范圍內呈上升趨勢[5]。這種異質性會影響細胞內關鍵的信號通路，驅動其表型變異，影響腫瘤的進化，并對肝癌的治療提出了嚴峻的挑戰。精準醫學的應用將對肝癌的治療策略產生一定的影響。本文將討論精準醫學框架下肝癌系統治療的最新進展和面臨的挑戰。

2 肝癌多學科治療的發展

原發性肝癌具有發病率高、預后差、死亡率高的特點，最新世界衛生組織的數據顯示其發病率在全球惡性腫瘤中的排名為第五位，死亡率則排第三位。我國是肝癌大國，更是乙型肝炎大國[5-6]。既往肝癌早期診斷較困難，就診時肝癌大多已發展至晚期，療效極不滿意[7]。近年來，隨著B超、CT、MRI等影像技術的發展、外科技術水平的提高及新技術的應用, 對肝癌的診斷、治療水平有了很大的提高。原發性肝癌的治療由早期的單純手術治療, 發展為包括手術治療、局部治療、放療、化療、免疫治療、基因治療及中醫中藥等的綜合治療[8]。通過對肝癌發生發展分子遺傳模式的研究，人們對肝癌的認識由早期的單一疾病發展為基因水平的認識, 對肝癌的治療也由過去的單一療法發展為包括系統治療在內的多學科綜合療法。筆者接下來將簡要闡述肝癌系統治療的歷史和發展。

3 肝癌靶向治療的進展

在過去的幾十年里，分子生物學的發展使學者們對腫瘤發生發展過程中的分子機制有了更深入的了解[9]。相反，這又為開發新的分子靶向藥物提供了機會，這些靶向藥物可以抑制肝癌中失調分子的異常，也成為治療肝癌的重要手段之一[10-12]。目前，許多臨床試驗正在尋找肝癌中作用于生長因子受體和細胞內信號通路的小分子藥物，比如這些通路參與細胞分化 (如Wnt)、增殖(如表皮生長因子、胰島素樣生長因子、干細胞生長因子及其受體c-MET、RAF/MEK/ERK)、生存(如AKT/m-TOR)、血管生成[如血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)]，有助于腫瘤生長和轉移。肝癌的靶向治療提供了潛在的分子靶標。靶向治療藥物具備靶向性、安全性、方便性等優點。

由于血管生成在肝癌發生發展過程中起著關鍵作用，比如最重要的VEGF及其他的血管生成途徑，因此開發有效的抗血管生成藥物是目前抑制肝癌發生發展的重要機制之一，以下是肝癌中確定的分子靶點和目前用于臨床或正在研究的靶向治療藥物[9,13-15]。

3.1 索拉非尼 抗血管生成的多酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是第一個靶向的系統性治療，于2007年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于治療晚期肝癌。索拉非尼通過阻斷生長因子的各種受體酪氨酸激酶(包括VEGF、PDGF和c-Kit)來顯示其抗腫瘤活性，從而抑制Raf/MEK/ERK介導的信號轉導[9]。SHARP和Oriental的兩項全球Ⅲ期隨機對照試驗顯示出索拉非尼能顯著提高不可切除和晚期肝癌患者的總體生存率[9,16-17]。與索拉非尼相比，舒尼替尼、厄洛替尼、布立尼布等小分子TKI均未顯示明顯的臨床獲益。

3.2 侖伐替尼 十多年來，索拉非尼一直是FDA批準的治療晚期、不能切除的肝癌的唯一一線治療藥物。侖伐替尼是一種VEGF1-3受體、FGF1-4受體、PDGFα受體、Ret和Kit的TKI[18]，在Ⅱ期臨床研究中發現侖伐替尼對不可切除肝癌有良好的臨床療效和安全性。REFLECT試驗(NCT01761266)是一項多中心隨機的非劣效性Ⅲ期臨床試驗[19-20]，研究發現侖伐替尼在總體生存率方面并不差于索拉非尼，而無進展生存率及客觀緩解率更優。

3.3 瑞戈非尼 瑞戈非尼是與索拉非尼結構相似的TKI。瑞戈非尼抑制VEGFR2、3，PDGFR，FGFR-1，Kit，Ret和B-Raf[21]。在一項隨機、雙盲、Ⅲ期臨床試驗(RESORCE試驗，NCT01774344)中[21]，在索拉非尼治療失敗后使用瑞戈非尼與安慰劑作為二線治療的對比中，瑞戈非尼的安全性與對照組相當。基于RESORCE試驗數據，FDA批準了瑞戈非尼作為治療肝癌的二線治療方案。未來的試驗正在探索瑞戈非尼與其他全身性藥物的聯合應用，希望能夠作為對不能連續耐受索拉非尼和瑞戈非尼的患者的三線治療[21]。

3.4 卡博替尼 卡博替尼是一種多重TKI，可抑制VEGFR 1～3、MET和AXL。對服用索拉非尼無效的不可切除肝癌應用卡博替尼的雙盲Ⅲ期臨床試驗(NCT01908426)[22-23]表明，與安慰劑組相比，卡博替尼組的中位總生存期明顯延長(10.2個月vs 8.0個月，P=0.005)，卡博替尼組與安慰劑組的平均無進展生存期分別為5.2個月和1.9個月[22]；卡博替尼組少數患者可出現5級不良反應，包括肝衰竭、門靜脈血栓形成、肝腎綜合征和肺栓塞[23]。根據上述試驗的數據，2019年1月，FDA批準卡博替尼作為曾接受索拉非尼治療進展的晚期肝癌患者的二線治療方案。

4 肝癌免疫治療的進展

肝臟中免疫微環境和非免疫微環境共同參與肝癌的免疫耐受及應答，影響肝癌的發展與患者預后。傳統的肝癌治療方案由于無法逆轉免疫耐受環境，免疫系統對藥物的敏感性不足，療效常不理想[6]。因此，臨床醫師應充分了解肝癌免疫微環境，完善治療策略提高肝癌的治療效果。腫瘤免疫治療是通過激發機體的免疫功能，增強腫瘤微環境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞的治療手段。與傳統肝癌治療手段相比，免疫治療發生嚴重毒性反應的概率更低，患者耐受性更好，可有效增強機體的免疫反應，延緩腫瘤的進展，一定程度上延長患者的生存時間。近年來，肝癌免疫治療逐漸成為研究熱點，并在臨床上取得了積極的效果，部分患者在接受免疫治療后生存周期延長，復發率降低。常用的免疫治療的方法有免疫檢查點抑制劑(ICI)治療[細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)單抗、程序性死亡受體1(PD-1)及其配體PD-L1 單抗等]、過繼免疫治療 (嵌合抗原受體T淋巴細胞免疫) 和腫瘤疫苗治療 (樹突狀細胞疫苗、溶瘤病毒疫苗等)[24]。

4.1 免疫檢查點抑制劑(ICI) 免疫檢查點分子PD-1是1992年由日本京都大學的TasukuHonjo教授和他的研究小組首次發現的。它被命名為程序性死亡受體1，因為研究人員發現它時正在尋找誘導T淋巴細胞凋亡的分子，后來發現它是一種負性調節免疫反應的受體。PD-1配體PD-L1和PD-L2也在2000年被發現[25-26]。后來發現，抑制這一途徑可以通過逆轉腫瘤的免疫抑制作用和恢復固有免疫活性來消除腫瘤，這促使后來在2002年開發利用這一機制的抗腫瘤藥物。1995年，James Allison發現了CTLA-4，并發現抑制其功能導致小鼠腫瘤消失[25]。這種調節T淋巴細胞活動的分子稱為免疫檢查點分子，而抑制這些分子的藥物稱為ICI。目前正在研究nivolumab和pembrolizumab作為抗PD-1抗體，avelumab、durvalumab和atezolizumab作為抗PD-L1抗體，以及iplimumab和trelimumab作為肝癌的抗CTLA-4抗體的多項臨床試驗正在進行中[25]。

nivolumb是世界上第一個抗人PD-1的重組人IgG4單克隆抗體。在晚期HCC的Ⅰ/Ⅱ期試驗(Checkmate-040試驗)[27]中，其有效率為20%，包括兩次完全緩解和67%的疾病控制率。nivolumab的另一個獨特之處是它的作用持續存在于應答者身上。此后，增加了試驗人數，最新結果在2017年美國臨床腫瘤學會年會上公布，一線治療的總生存期結果為28.6個月，二線治療為15.6個月[27]。上述Ⅰ/Ⅱ階段試驗的結果，美國FDA指定nivolumab進行優先審查，并于2017年9月獲批。pembrolizumab與nivolumab一樣，是一種抗人PD-1的重組人IgG4單克隆抗體。在Ⅱ期試驗中對肝癌進行了研究，結果與nivolumab相似[26-27]。但兩項大樣本的Ⅲ期研究checkmate459、KEYNOTE-240均未得出陽性結果，提示nivolumab及pembrolizumab單藥療效仍需提升[28]。

4.2 嵌合抗原受體T淋巴細胞(CAR-T)免疫 在評估CAR-T細胞治療肝癌的少數研究中，最常用的治療方法是第三代療法，其特征是CD28和CD134(或4-1BB)與CD3-ζ結合的共刺激域。一系列的肝癌生物標志物使用這項技術進行了靶向研究[29-30]。PC3靶向的CAR-T細胞可以根除GPC3(+)HCC異種移植物，但不能根除GPC3低表達的病變(NCT027239942、NCT02395250、NCT03084380和NCT03198546)[31]。類似的結果也在肝癌患者的異種移植模型中得到證實。靜脈注射甲胎蛋白靶向的CAR-T細胞導致腫瘤生長抑制。抗癌胚抗原(CEA)的CAR-T細胞的臨床活性可能對肝轉移瘤的治療是安全有效的[30-32]。抗CEA CAR-T細胞與骨髓來源的抑制性細胞靶向藥物聯合治療CEA陽性的肝癌[31]。骨髓來源的抑制性細胞損耗能減少腫瘤源性PD-L1和PD-1在CAR-T中的結合細胞。其他生物標志物，如HBV、SP17、FAP、黏蛋白-1，EpCAM、c-Met/PD-L1、ET1402L1、glypican-3和EGFRvⅢ也已在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(NCT03349255、NCT03672305、NCT02905188、NCT03980288、NCT03884751、NCT03146234和NCT02587689)開展[30-32]。然而，由于腫瘤相關抗原通常在正常組織中呈現低水平，因此若要利用腫瘤相關抗原靶向腫瘤細胞，研究者們仍需要考慮在實際過程中的脫靶效應和靶向非腫瘤細胞導致的副作用。為了降低風險，多靶點CAR-T細胞被開發用于治療肝癌，例如GPC3和去唾液酸糖蛋白受體1(肝組織特異性蛋白)可靶向CAR，CAR-T和T淋巴細胞受體基因轉導的T淋巴細胞(NCT03941626)[33]。臨床試驗中經常遇見的障礙包括細胞轉運、缺乏特定的腫瘤抗原以及CAR-T細胞在腫瘤部位的滲透[30-32]。考慮到肝癌發生發展的復雜機制，CAR-T細胞治療聯合其他免疫療法或TKI可能是克服這些障礙的可行策略[33]。

4.3 系統治療中的聯合療法

免疫治療單藥對肝癌的療效并不滿意，有可能的原因是肝臟對抗原具有相對較高的生理免疫耐受性，因為免疫抑制成分和因子如Treg、腫瘤相關巨噬細胞和IL-35的上調。另一個原因是PD-1、TIM-3、CTLA-4和Raf-1等多種途徑參與了肝癌的發生和發展，為突變體肝細胞的生長建立了一個難治的免疫耐受性微環境，從而導致對單一免疫療法的抵抗。此外，大多數免疫療法都有嚴重的劑量依賴性副作用，例如皮疹、腹瀉、肺水腫和細胞因子風暴，這些副作用隨著劑量的增加而表現出來[34]。因此，將多種免疫治療、免疫與靶向、免疫治療與局部治療等的結合，是聯合治療的一個重要方向。

4.3.1 抗血管生成治療聯合免疫治療 TKI如索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼等已用于肝癌的一線和二線治療。它們主要通過抑制VEGF受體(VEGFR-1-3)、血小板源性生長因子(PDGFα和PDGFβ)、STAT3和激酶級聯的各種蛋白質來靶向多種激酶[9,18,21]。盡管TKI在臨床試驗中有明顯的益處，但耐藥性和上述不良反應限制了這些治療方法在少數患者中的應用。VEGF的抗體藥物貝伐單抗等有類似的療效及耐藥問題。此外，TKI既可減少細胞周期失調或腫瘤細胞凋亡，又可通過誘導缺氧或調節代謝等途徑調節瘤周免疫細胞的分子表達[9]。因此，將免疫治療與TKI結合可能是治療HCC的一種有前途的策略。近年來，ICI與TKI或抗體藥物聯合應用已成為肝癌治療的一個熱點。多項類似聯合治療的研究正在進行，部分甚至已經獲得了40%～50%的客觀緩解率數據。已發表的Ⅲ期臨床研究顯示，阿特珠單抗聯合貝伐單抗對比索拉非尼用于晚期肝癌的一線治療，靶向聯合免疫治療取得了總生存期及無進展生存期雙終點的陽性結果。因此美國國立綜合癌癥網絡已將此組合療法納入肝癌一線系統治療推薦[35]。侖伐替尼聯合派姆單抗用于不可切除肝癌的Ⅰb期研究近期已發表，聯合治療獲得了高達46%的客觀緩解率(mRECIST)[36]。另一項名為COSMIC-312(NCT03755791)的Ⅲ期臨床試驗[37]發現，在既往未接受全身性抗癌治療的晚期肝癌患者中，阿特珠單抗聯合卡博替尼較單用索拉非尼具有明顯優勢。這些組合的最佳搭檔還在不斷探索，總體已顯示非常高的治療響應，成為肝癌系統治療中最有活力的研究領域。

4.3.2 系統聯合局部治療 目前一些研究[38-39]正在評估抗腫瘤免疫與常規局部治療相結合的臨床效果。先前的研究發現，經肝動脈化療栓塞(TACE)、射頻消融(RFA)甚至放療都能激活宿主免疫系統，釋放局部炎癥因子和新抗原。對于接受根治性切除的肝癌患者，與僅接受手術的患者相比，細胞因子誘導的細胞毒性治療加手術療法顯著改善了無病生存期和總生存期[40]。tremelimumab(替西木單抗)聯合RFA或TACE(NCT01853618)被認為是晚期HCC患者的輔助治療[41]，約有26%的患者體現出較好的部分反應。最近，一項Ⅲ期研究(NCT03778957)評估TACE聯合貝伐單抗和durvalumab對局部進展期肝癌療效。另一項研究(NCT0281754)評估了durvalumab和替西木單抗與消融療法(如TACE、RFA和冷凍消融)在晚期HCC患者中聯合應用的效果。NCT03572582研究評價了抗PD-1抗體nivolumab聯合TACE的有效性和安全性。總的來說，這些已完成和正在進行的臨床試驗有望為難治性肝癌確定合適的治療策略。

5 系統治療在肝癌多學科治療中的價值

HCC的系統治療過去僅限于晚期患者，而靶向腫瘤血管生成的TKI是開發新治療方案的主要途徑。在過去的3年里，分子靶向治療和ICI試驗的新數據為晚期肝癌的一線和二線治療提供了許多新的選擇[24,39]。最值得注意的是，將PD-1途徑的ICI與其他新型藥物或常規抗癌治療相結合，可進一步提高不同臨床環境下的治療效果。目前肝癌的系統治療涉及多個學科和多種方法，并且可以根據不同患者的腫瘤生物學、全身狀況、驅動突變基因的特性來選擇不同方法，復旦大學附屬中山醫院是國內建立肝癌多學科治療最早的單位之一，肝癌多學科治療的精髓正在于系統治療，而系統治療的關鍵也正是基于精準醫學的理念[42]。

6 肝癌系統治療中的精準醫學理念的應用

肝癌是一種高異質性的惡性腫瘤，目前大多數臨床試驗的納入標準主要基于肝功能和腫瘤分期(如Child-Pugh A級和肝外擴散和/或血管侵犯的存在)。然而，其實很多臨床試驗中招募的肝癌患者在腫瘤的生物學特性上并不一致。因此，最近提出了通過生物標志物(例如基因異常和表達的蛋白質)來優化患者選擇[29]。例如，c-MET的過度表達被用作tivantinib 試驗中的生物標志物[29]，RAS蛋白被用作MEK抑制劑試驗中的生物標志物。目前正在進行一項使用FGF19作為生物標志物的FGF受體抑制劑的試驗[43]。然而，在tivantinib 的Ⅲ期研究和MEK抑制劑的Ⅱ期研究的陰性結果之后[44-45]，這兩種藥物的開發被中止。在肝癌的靶向及免疫治療中，目前并無可以明確提示療效響應的分子標志物。因此，單純靠這些基于生物標志物的研究來篩選特定符合某種治療的肝癌患者人群，以此達到精準治療的目的。目前來說這樣的研究設計理念還不足以更精準地“靶向”不同肝癌人群。因此，對腫瘤細胞內部的深度測序，探索不同肝癌分子-基因層面的內在機制，并結合臨床相關病理特征可以為肝癌提供更精準的預測和治療。

隨著新一代組學技術對肝癌多維度、多層次和跨組學的深度解析，基于轉錄組、蛋白質組和腫瘤微環境的分子分型研究也得到快速發展。由于蛋白質是生命活動的直接執行者，蛋白組學是尋找分子標志物有效方法之一[46]。同時蛋白組學也是尋找藥物靶標的有效途徑，目前以TKI為主的肝癌靶向藥物以及以ICI為主的免疫治療直接作用靶點均為蛋白質。近日，筆者團隊[6]通過蛋白組學分析比較110例早期肝癌的分子特征，系統揭示了我國早期肝癌的異質性，并將其分為S-Ⅰ～Ⅲ 3個亞型。其中S-Ⅲ亞型高表達TGFβ等腫瘤增殖相關蛋白，預后差；S-Ⅱ亞型、 S-Ⅰ亞型以WNT、CTNNB1高表達為特點。在預后最差的S-Ⅲ亞型早期肝癌中，甾醇氧-乙酰轉移酶(sterol O-acyltransferase,SOAT)1高表達，下調SOAT1后細胞質膜上膽固醇分布發生了改變，而且肝癌細胞的增殖和遷移得到有效抑制[6]。同時，SOAT1抑制劑avasimibe在人肝癌移植瘤模型中的抑制作用進一步表明SOAT1可能成為S-Ⅲ亞型即Hoshida S1亞型肝癌的新靶標。此外，筆者團隊[6]對159例乙型肝炎相關肝癌進行外顯子、轉錄組、蛋白組、磷酸化組的多組學分析，結果顯示：肝癌被分為代謝驅動型(S-Mb)、微環境失調型(S-Me)以及增殖型(S-Pf)3個亞型。其中，S-Mb亞型高表達ACAT1、ADH1A、G6PC等代謝相關蛋白，提示其保留了部分正常肝功能，預后最好；S-Pf亞型的腫瘤中高表達PARP1、TOP2A、PCNA等增殖相關蛋白，預后最差；S-Me亞型低表達CD4、CD8A、S100A12等免疫、炎癥和基質相關蛋白，預后介于兩者之間。值得注意的是，36例蛋白組分型和轉錄組分型歸類不一致肝癌患者的樣本，蛋白分型可以提供更好的預后分析。基于上述中國人肝癌蛋白組學數據的分析結果，馬兜鈴酸的突變“指紋”與腫瘤突變負荷、腫瘤新抗原負荷、CD8+T淋巴細胞浸潤、免疫微環境耐受(ICOS、OX40、PD-1和LAG3等免疫檢查點豐度)呈顯著正相關，提示該類患者可能從免疫治療中獲益。另一方面，CTNNB1突變患者微環境中表現為免疫豁免型，可能無法從免疫治療中獲益，進一步通過肝癌的多組學分析發現CTNNB1突變與果糖二磷酸醛縮酶A(fructose-1，6-bisphosphate aldolase，ALDOA)第36位絲氨酸的磷酸化相關。ALDOA磷酸化通過促進無氧糖酵解促進腫瘤細胞增殖，敲減ALDOA顯著抑制腫瘤增殖。因此，ALDOA可能是CTNNB1突變亞型肝癌的一個重要潛在治療靶點[6]。

7 小結與展望

中國肝癌的發病率和死亡率均超過全世界50%。近幾年肝癌藥物治療繼索拉非尼之后，侖伐替尼、瑞戈菲尼、卡博替尼、抗EGFR抑制劑、以ICI為核心的組合療法層出不窮，促進肝癌藥物治療的進步。但是，由于肝癌的高度異質性，上述藥物的整體有效率依然有限，預測療效的分子靶標依然缺乏。精準的肝癌分子分型不僅有助于肝癌個體化診斷與治療的決策、個性化的藥物治療，而且將極大加深臨床醫師對肝癌復雜性和異質性的理解，以便制訂更加精準、有效的治療策略。肝癌的系統治療更是要與新的分子分型體系，臨床病理信息緊密結合，同時要結合精準的分子標志物療效預測，從而最大程度地提高肝癌患者生存率。