利用全外顯子組測序技術對高度近視家系進行致病基因的克隆研究

鄧妮妮

（防城港愛爾眼科醫院有限公司，廣西 防城港 538001）

近些年來，研究證實[1]，父母近視發生與子代近視發生率呈現正相關。隨著近些年來全外顯子測序技術的發展，高度近視發病率高于人口總數的1%。因此，定位與克隆中國人群高度近視致病基因，并在此基礎上進行功能學研究，對預防及改善近視人群健康水平、生活質量具有重大科學價值及社會意義[2]。為此，文章就應用全外顯子組測序技術測定高度近視家族致病基因克隆研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1月—2018年12月期間采集了5個高度近視家系成員進行病史采集、視力檢查、屈光度、眼軸長、角膜曲率、眼底照相、OCT、色覺檢查及繪制家系圖并收集外周血提取DNA。本次研究經我院倫理委員會批準；所有檢查及采樣均告知被檢查對象，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 選取家系成員進行外顯子組測序：選擇兩個遺傳關系最遠的患者和與其中一個患者親屬關系最近的一個正常人作為對照進行外顯子組測序。

1.2.2 全基因外顯子組測序結果分析：選取HighSeq2000高通量雙末端進行測序，對所獲取圖像文件，選取Illumina basecalling Software 1.7進行堿基讀取，并獲取長為76bp雙末端序列。①據產出統計：比對軟件為bwa，對高質量原始序列，對比到參考基因組上，包括hg19，NCBI b37，通過SNP標注等分析，選取外顯子并捕獲相關樣本基本信息，能獲取捕獲數據，判斷是否符合要求。②SNP檢測和注釋：bwa軟件序列下所獲取結果，選取GATK工具重新對序列質量評估，并過濾匹配值基因組相同起始位置，重復拷貝后，選取samtools開展SNP檢測。對SNP進行檢測，此時選取質量≥30Phred-like質量、測序深度≥8的SNP后，并進行注釋及功能預測。③插入/缺失檢測和注釋：選取GATK工具，對外顯子區插入與缺失檢測，產生indels 的*.bed文件，對后續Indels注釋。④標注好結果與dbSNPR 129、Hapmap8等數據庫過濾，去除數據庫內報道過的SNP，得到所有未報道過的NS/SS/Indel結果。⑤未報道NS/SS/Indel數據獲??；⑥家系內患者共有未報道 NS/SS/Indel結果生物信息學分析和突變后的功能預測[PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)]，找到最有可能的候選致病基因。

1.2.3 致病基因在其他高度近視家系和散發患者中的突變篩查：設計引物，通過Sanger測序，在其他高度近視家系及散發病例中對上一步驟獲得的共分離突變的基因進行突變篩查。

1.2.4 致病基因細胞模型的構建和基因功能的初步探索：構建相應致病基因野生型蛋白和突變蛋白的表達載體，轉染Hela或其他合適細胞，建立穩定表達野生型和突變型蛋白的穩定細胞系。在瞬時轉染和穩定細胞系中，觀察突變蛋白的亞細胞定位，了解其合成、轉運和成熟的過程是否對其行使正常生理功能有影響，突變蛋白的降解過程是否有異常。

2 結 果

5個高度近視家系成員中，家系1表現為無虹膜、后部脈絡膜缺失及黃斑發育不良。家系2眼底視網膜豹紋狀改變伴有斜視及眼球震顫。家系3、家系4、家系5視網膜豹紋狀改變、視盤顳側可見近視弧形斑，視網膜未見明顯色素沉著，黃斑中心凹反光可見，最佳矯正視力可達0.4～1.0。所有家系成員未出現全身系統性疾病。5個高度近視家系中選取了遺傳模式典型、家系成員多且表型特征明顯的1個家系進行了全外顯子組測序，成功鑒定了NYX基因的一個新突變位點與該高度近視家系的疾病表型共分離。

3 討 論

高通量測序應用能發現可能與高度近視相關基因，涉及到神經傳遞、視黃酸代謝及胞外基質重建等基因，如GJD2、 RASGRF1、GRIA4等基因[3]。新一代測序技術的進步，使外顯子組測序和靶向外顯子捕獲測序得到了快速發展，為尋找高度近視致病基因及其突變位點提供了契機。

廣西是多民族聚居的自治區，特殊的地理環境又使各民族長期隔離，這便形成了廣西少數民族遺傳結構的多樣性和民族背景的單一性。2016年我們率先在廣西開展高度近視疾病樣本資源庫建設，期望能夠有效推動對高度近視發病機制的研究。通過收集5個高度近視家系及60多個高度近視散發病人，登記了詳細的臨床資料和提取了高質量的DNA樣本；從這5個高度近視家系中選取了遺傳模式典型、家系成員多且表型特征明顯的1個家系進行了全外顯子組測序，成功鑒定了NYX基因的一個新突變位點與該高度近視家系的疾病表型共分離。并且已將研究結果反饋給患者，并為患者家庭的下一代優生優育提供咨詢和指導[4]。隨著疾病資源庫標準化及流程規范化建設，對高度近視家系研究不斷深入，后續可能克隆新的遺傳性高度近視致病基因，為揭示遺傳性高度近視病因及致病機理、臨床基因診斷提供充分依據。

綜上所述，全外顯子組測序技術對高度近視家系進行致病基因的克隆，為進一步揭示遺傳性高度近視的病因和致病機理以及臨床基因診斷提供更充分的證據。