永生化人肝星狀細胞株WM07 的建立

郭津生 王 滿

（復旦大學附屬中山醫院消化科 上海 200032）

肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝臟的一種非實質細胞，在肝纖維化發生中起到關鍵作用。原代分離的HSC 在體外的培養和傳代時間有限，傳代一定次數后就會進入衰老期而不能再繼續增殖。而反復分離原代細胞不僅費時、費力，且各批次細胞間存在差異，不能保持細胞生理指標的穩定性。體外能無限培養的永生化HSC 的建立可為科學研究提供穩定、充足的細胞材料。建立和改良人HSC 的分離培養方法及獲得永生化人HSC 株對于肝纖維化發生機制、診斷及治療研究具有重要意義。

已有通過脂質體介導猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）大腫瘤抗原（large tumor antigen，TAg）基因的真核表達質粒轉染獲得永生化人HSC（LX1 及LX2）的報道［1］。既往研究中，我們采用改良酶液灌注消化及密度梯度離心兩步法從1 例中國兒童肝腫瘤手術患者的肝臟標本中分離HSC［2］，液氮凍存原代細胞。本研究通過構建慢病毒SV40 TAg 表達質粒，介導SV40 TAg 轉染該原代HSC，獲得永生化人HSC 株（命名為WM07），可穩定傳代并用于肝纖維化研究。

材料和方法

構建SV-40 TAg 慢病毒表達載體

PCR 獲取全長SV40 TAg 序列 以含SV40 TAg cDNA 序列的SV40 tsA58 質粒［3-5］為模板，根據NCBI 的SV40 TAg 完整基因參考序列（NC_001669.1）設計特定的質粒構建引物。SV40 TAg-CF：5’-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3’；SV40 TAg-CR：5’-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGA-3’。

高保真PCR 獲取SV40 TAg 全長cDNA PCR反應體系（50 μL）：引物混合液1.5 μL，10×Pfu DNA 聚合酶反應混合物（含dNTP）5 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 質粒1 μL，用滅菌去離子水補齊到50 μL。PCR 反應條件：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，68 ℃4 min，36 個循環；68 ℃5 min；恢復至4 ℃。

PCR 產物純化 PCR 產物進行1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，切割回收SV40 TAg 全長cDNA PCR 條帶，pureLinkRQuickGel（美國Invitrogen 公司）提取純化PCR 產物，測定并調整為10 ng/μL濃度。

PCR 產物TOPO 克隆進入pENTRTMTOPO?載體 純化的SV40 TAg PCR 產物4 μL，鹽溶液1 μL，pENTRTMTOPO?載體（美國Invitrogen 公司）1 μL，總體積6 μL，室溫輕柔混勻，室溫放置30 min，置于冰上。

轉化和Entrez 克隆篩選 TOPO?克隆反應產物2 μL 轉化感受態大腸埃希菌（E.coli），接種于卡那霉素LB 瓊脂板，37 ℃培養過夜，挑選5 個生長菌落擴增和提取質粒，以M13 正向和逆向引物進行PCR 測序（韓國Macrogen 公司），鑒定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，獲得pENTR-SV40 TAg Entrez質粒。

LR重組反應 1.5 mL離心管中加入7 μL上述克隆表達質粒pENTR-SV40 TAg（150 ng）、1 μL 目標慢病毒載體pLenti4/V5-DEST（美國Invitrogen 公司）、8 μL TE 緩沖液、2 μL LR Clonase?Ⅱenzyme mix，混勻，25 ℃孵育1 h，加入1 μL 蛋白酶K 溶液終止反應，混勻后37 ℃孵育10 min。

將SV40 TAg cDNA 克隆到目標慢病毒載體轉化1 μL LR 反應液與50 μL Stbl3TM感受態細胞，冰上孵育30 min，42 ℃熱休克30 s，加入250 μL SOC 培養液，37 ℃振搖培養1 h，分別將20 μL 和100 μL 轉化液鋪于氨芐青霉素LB（LBA）瓊脂板。37 ℃培養過夜，挑選5 個生長菌落擴增和提取質粒。以CMV 正向和逆向引物進行PCR 測序（韓國Macrogen 公司），鑒定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，構建SV40 TAg 慢病毒表達載體pLenti4/V5-GW/SV40 TAg。

慢病毒包裝采用脂質體LipofectamineTM3000介導pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒質粒（假病毒）和包裝質粒pCMV-VSV-G 及psPAX2（2∶1.5∶1）轉染工程細胞293FT，進行假病毒包裝，24、48、72 h 分別收集含包裝病毒的培養上清液，離心，凍存備用。

HSC 分離和原代培養復旦大學附屬中山醫院外科手術切除人肝臟腫瘤標本，無菌操作切取病灶周圍相對正常的一小塊肝組織，按5 mL/g 用EGTA 液（含肝素20 U/mL）沿血管殘端反復灌注沖洗殘余血液，至肝組織呈灰黃色。采用改良酶液灌注消化及Nycodenz 密度梯度離心兩步法獲得原代HSC［2］。采用常規臺盼藍拒染法鑒定細胞活力。采用自發藍綠色熒光、油紅O 脂滴染色、α-平滑肌肌動蛋白（α-smα-SMA）、免疫熒光染色等方法鑒定細胞純度［2］，每3 天換液1 次，原代凍存。

永生化HSC 株WM07 的建立

SV40 TAg 轉染原代培養細胞并篩選轉染細胞 以含SV40 TAg 的慢病毒培養上清液加入細胞培養液中轉染原代（復蘇第2 代）培養細胞，48 h 后換用含50 μg/mL 博來霉素（zeocin）的10%胎牛血清的DMEM 培養液篩選轉染和穩定表達SV40 TAg的原代細胞，每3天換液1 次，2～4 周后可篩選出存活細胞克隆，擴增成株。細胞株至少能穩定傳十代。

SV40 TAg 表達的檢測 一抗采用抗SV40 TAg 抗體（1∶200，美國Santa Cruz 公司，sc-148），用Alexa Fluor 594（紅色）標記的二抗進行免疫熒光染色，檢測SV40 TAg，可作為SV40 TAg 轉染獲得永生化細胞的標志。

α-SMA 的檢測 一抗采用抗α-SMA（1∶500，英國Abcam 公司，ab5694），用Alexa Fluor 488（綠色）標記的二抗進行免疫熒光染色檢測α-SMA，作為活化HSC 的標志。

結果

SV40 TAg 全長cDNA 的鑒定高保真PCR 獲取的SV40 TAg 全長cDNA 經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR 條帶大小符合全長SV40 TAg cDNA 片段大小（2 477 bp，圖1）。

圖1 高保真PCR 獲取SV40 TAg 全長cDNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis map showing a single band of high-fidelity PCR product of SV40 TAg full-length cDNA fragment

pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒的鑒定通過M13 正向引物對pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒進行PCR 測序，結果驗證所構建的pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒含CACC 克隆位點（122～125）、ATG 轉錄起始位點（126～128）及SV40 TAg cDNA序列（圖2）。

慢病毒表達質粒pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 的鑒定通過CMV 正向引物對pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表達質粒進行PCR 測序，結果驗證所構建的質粒含ATG 轉錄起始位點（151～153）及SV40 TAg cDNA 序列（圖3）。

永生化HSC 株WM07 表達>SV40 Tag對經慢病毒介導SV40 TAg 轉染、博來霉素篩選獲得的永生化肝星狀細胞株WM07 進行SV40 TAg 的免疫熒光染色，結果顯示WM07 表達SV40 TAg，并在細胞核表達和定位（圖4）。

永生化HSC 株WM07 表達活化HSC 標志物免疫熒光染色鑒定顯示，WM07 細胞質內均表達活化HSC 的特異性標志α-SMA（圖5）。

討論

圖2 M13 正向引物對pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒進行PCR 測序的結果Fig 2 The PCR sequencing result of pENTR-SV40 TAg Entrez plasmid by M13 forward primer

圖3 CMV 正向引物對pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表達質粒進行PCR 測序結果Fig 3 PCR sequencing result of the expression plasmid of pLenti4/v5-GW/SV40 TAg lentivirus with CMV forward primer

圖4 免疫熒光染色永生化HSC 株WM07 的SV40 TAg 表達（×100）Fig 4 Immunofluorescence staining of SV40 TAg expression in theimmortalized HSC line WM07（×100）

圖5 免疫熒光染色永生化人HSC 株WM07 的α-SMA 的表達（×20）Fig 5 Immunofluorescence staining of α-SMA expression in immortalized human HSC line WM07（×20）

一些抑癌基因p53 和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人體細胞獲得永生化的必要條件。哺乳動物細胞使用幾種方法誘導細胞永生化，包括使用SV40TAg基因、人類端粒酶逆轉錄酶基因、P53 和pRB 的小發卡或短發卡RNA（shRNA）等。SV40 TAg 是由SV40 病毒早期編碼區編碼的一種多功能磷酸蛋白，在病毒復制過程中發揮重要作用。SV40 TAg 具有活化宿主細胞核糖體基因、誘導DNA 合成、修飾蛋白質合成起始因子等作用，并且能結合、調控某些關鍵性的細胞調控蛋白，如視網膜母細胞瘤蛋白家族成員（如pRB）、腫瘤抑制因子P53 等，并可誘導感染細胞的端粒酶活性，誘導多種細胞的永生化。SV40TAg基因與宿主細胞DNA穩定整合重組后，不但能在細胞內表達SV40 TAg，加快轉化細胞的生長速率，同時也能保留原始細胞的許多分化表型，具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，而在轉化細胞系中非原始基因的表達很少見。

目前已有一些方法用于介導SV40 TAg 轉染，如通過脂質體介導構建有SV40TAg基因的真核表達質粒載體，轉染目標原代細胞，并篩選獲得永生化細胞系的方法，但其轉染效率較低，篩選困難，一些較難轉染的細胞難以獲得穩定表達和建立細胞系。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，能夠將靶基因導入一些較難轉染的細胞內，可以有效感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，并且將靶基因隨機整合到宿主HSC 基因組中，從而大大增加了感染效率，并且能夠在細胞系中穩定表達若干代，可以進行穩轉細胞株的篩選。慢病毒已廣泛用于基因功能研究、RNA干擾、小分子RNA 研究及活體動物實驗中，成為基因治療的有力工具之一。既往研究中，我們采用慢病毒載體構建和轉染方法成功進行了Toll 樣受體4及DDX5 單核苷酸基因多態性的表達和功能探討［7-8］。本研究構建一種能夠高效、快速轉染SV40 TAg 慢病毒的表達載體，該載體通過工程細胞包裝可獲得表達SV40 TAg 的慢病毒顆粒（假病毒）用于轉染原代人HSC，進而通過博來霉素抗性特點篩選獲得永生化細胞株。提供一種構建永生化細胞株的方法，并獲得一株永生化HSC 株WM07，可穩定傳代，并可用于肝纖維化研究，具有重要的應用價值。

致謝美國紐約西奈山肝病中心Scott L.Friedman 教授給予指導和幫助。