肝臟淋巴管新生在肝纖維化進展中的作用

石 納，陳修利，吳 昊，毛靖偉

大連醫科大學附屬第一醫院 消化內科，遼寧 大連 116011

肝纖維化的發展是一個持續應對慢性肝損傷的愈合過程，其特點是基質蛋白產生增加且基質重塑失衡[1]。血管生成是機體損傷愈合反應的主要特征，而損傷愈合的慢性持續激活是慢性肝臟病發展的重要機制[2]，因此，血管生成與肝纖維化密切相關。與此同時，肝硬化門靜脈高壓往往伴有腹水，且腹水與肝硬化程度相關，肝硬化腹水的形成、代謝與肝臟淋巴系統密不可分[3]。肝臟微環境的改變能夠引起包括淋巴液產生、淋巴管新生、淋巴液含量以及引流淋巴結內免疫反應等一系列變化。肝硬化及其前期肝纖維化可伴有肝臟淋巴系統功能及結構的改變。肝纖維化過程中肝臟匯管區伴有明顯的淋巴管新生，而且新生淋巴管的數量與肝纖維化嚴重程度相關。淋巴管新生過程中，肝臟Kupffer細胞、淋巴管內皮細胞(lymphatic endothelial cells, LyEC)的功能及狀態能夠影響肝纖維化的發展。以下就淋巴管新生的分子機制及其在肝纖維化中的作用展開綜述。

1 淋巴管標志物及其在肝臟內的表達

淋巴管系統是由封閉的毛細淋巴管和較大的收集淋巴管構成，毛細淋巴管由單層LyEC組成。淋巴管標記通常指LyEC上特定的物質，目前公認的標志物有：淋巴管透明質酸受體1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1, LYVE-1)、果蠅同源盒基因轉錄因子1(prospero homeobox-1, Prox-1)、腎小球足細胞膜黏蛋白(Podoplanin)以及血管內皮細胞生長因子受體3 (vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)。由于LYVE-1和Prox-1也分別在肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)和肝細胞中表達，因此，未來需要鑒定出在肝臟中更特異性LyEC標志物。

1.1 淋巴管透明質酸受體1(LYVE-1) LYVE-1廣泛分布在淋巴管內外腔面，參與LyEC從組織攝取并轉運透明質酸鹽進入淋巴液的過程，其還參與部分白細胞和腫瘤細胞的淋巴結歸巢[4]。LYVE-1在巨噬細胞、脾竇狀內皮細胞、肺臟及腎上腺血管內皮細胞中也表達[5]。在肝組織中，LYVE-1不僅在LyEC中表達，在肝細胞及LSEC上也分別有表達[6]。LYVE-1在人肝細胞癌中的表達水平與患者總體生存率相關[7]。在慢性肝炎和肝硬化中，LYVE-1在LSEC的表達減弱，特別是在活動性炎癥或纖維化病變附近的區域，LYVE-1在LSEC表達的減弱與肝病的進展有關[8]。

1.2 果蠅同源盒基因轉錄因子1(Prox-1) Prox-1是一種保守的同源異型核轉錄因子，它在胚胎形成以及在神經系統、眼、肝臟、胰腺、淋巴管和心臟等組織器官的生長發育中發揮重要作用[9]。Prox-1是LyEC從胚胎靜脈分化的早期步驟的關鍵轉錄因子，對于淋巴管系統的發展必不可少[10]。Prox-1主要在細胞核中表達，其表達對內皮細胞向淋巴管系統定向分化、淋巴管內皮囊的出芽至關重要。Prox-1也可表達于肝細胞，并在早期肝形態發生過程中調節肝細胞遷移。正常膽管細胞Prox-1表達為陰性，而在肝硬化的纖維化間隔內、膽管細胞癌和肝癌的膽管上皮細胞表達呈陽性[11]。Shimoda等[12]發現Prox-1表達與肝細胞癌分化評分之間存在顯著相關性，Prox-1在腫瘤中的低表達與不良預后密切相關，其可能作為肝癌診斷和治療的靶點。

1.3 腎小球足細胞膜黏蛋白(Podoplanin) Podoplanin是一種存在于腎小管膜上皮細胞上的黏液樣跨膜糖蛋白，主要表達在人腎足突細胞、肺Ⅰ型上皮細胞和成骨細胞以及LyEC，但僅出現在小淋巴管，其表達受Prox-1的調控[13]。Podoplanin是C型凝集素受體CLEC-2的配體，在血小板和免疫細胞中高度表達并促進血小板的聚集和激活[14]。Podoplanin基因完全敲除小鼠在出生時因呼吸衰竭死亡，同時伴有先天性淋巴管缺損而引起的淋巴水腫；Podoplanin雜合子僅表現為部分淋巴管發育不完全，但能夠健康存活[15]。在肝硬化失代償期患者肝組織中，Podoplanin表達陽性的淋巴管明顯增多；在原發性膽汁性肝硬化患者肝臟中，Podoplanin表達陽性的成纖維網狀細胞顯著增加[6,16]。

1.4 血管內皮細胞生長因子受體3(VEGFR-3) VEGFR-3屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族的淋巴管內皮標志物，為血管內皮細胞生長因子(VEGF)C的特異性受體，在淋巴管生成中起關鍵作用。VEGFR-3主要表達于LyEC，激活VEGF-C/VEGFR-3信號通路能夠誘導LyEC的增殖和遷移，并調節淋巴管新生[17]。VEGF-C與VEGFR-3結合后，使得VEGFR-3二聚體化并增強細胞質中絡氨酸激酶磷酸化，導致下游信號如絲裂原活化蛋白激酶以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)傳導增強，引起細胞效應。在膽管結扎后導致膽汁淤積的大鼠肝臟中VEGFR-3表達增加[18]。原發性膽汁性肝硬化的肝細胞也表達VEGF-C及VEGFR-3，推測其與肝纖維化及血管新生有關[19]。目前認為，VEGFR-3并不作為特異性LyEC標志物，但其可與其他標志物合用以提高LyEC檢出率。

2 淋巴管新生的主要途徑

淋巴管新生主要包括3種途徑。(1)原有淋巴管在以出芽方式形成新的淋巴管：VEGF-C/VEGFR-3信號是淋巴管持續出芽和遷移過程的重要刺激因素，VEGF-C對于淋巴管的出芽必不可少[17]。(2)外周血管內皮祖細胞遷移至局部組織并轉分化為LyEC：血管內皮祖細胞從胚胎靜脈遷移同樣依賴VEGF-C；但VEGF-C未與VEGFR-3結合的情況下，VEGF-C也可以通過其他受體如神經纖毛蛋白2結合進而介導淋巴管萌發和遷移[20]。(3)單核巨噬細胞在VEGF-C等因子作用下向LyEC轉分化[21-22]。但在肝纖維化過程中，Kupffer細胞能否誘導轉分化為LyEC尚未明確。

3 淋巴管新生與肝纖維化

淋巴管新生除了參與腫瘤轉移、炎癥、傷口愈合及器官移植等過程外，其在組織及器官的纖維化過程中也起重要作用。淋巴管能夠通過回流組織間的滲出液，維持組織液的動態平衡；LyEC也可通過趨化因子及與受體結合等方式介導免疫細胞的招募與歸巢，從而調節免疫反應[23]。肝臟是最大的淋巴液生成器官，肝臟中的淋巴管也起著維持體液平衡和調節免疫系統的作用。急性肝損傷過程中，VEGF-C/VEGFR-3信號的激活增加了淋巴管生成和修復性巨噬細胞的數量，兩者通過減輕缺血/再損傷，有助于肝損傷修復[24]。而在慢性肝硬化及纖維化患者肝臟內淋巴液生成大幅度增加，伴隨大量淋巴管新生，繼而引發肝臟內免疫反應，參與纖維化過程[25]。

3.1 淋巴管新生在肝纖維化中的作用 在肝纖維化進展過程中，由于中央靜脈及匯管區的組織結構破壞，肝竇血流阻力增加，血漿成分滲漏增加，導致淋巴液的生成增多，腹水形成。淋巴液生成增多導致的腹水形成是肝纖維化及肝硬化患者體內肝臟淋巴系統紊亂的公認臨床表現[6]。正常肝臟淋巴管所在匯管區分布大量巨噬細胞即Kupffer細胞，在病理狀態下，LyEC與包括Kupffer細胞在內的免疫細胞相互作用介導免疫細胞在機體內的遷移，并促進機體的自身免疫耐受及增強保護性免疫功能[26]。因此，肝臟中的淋巴系統對于維持體液和免疫調節起到了關鍵作用。包括肝纖維化、肝硬化、病毒性肝炎、原發性膽汁性膽管炎和肝細胞癌在內的多種肝臟疾病均存在淋巴管數量的增加(即淋巴管新生)現象[6]。肝纖維化及肝硬化患者肝臟淋巴液生成顯著增加，并伴隨肝內大量淋巴管新生[25]。在肝纖維化、肝硬化以及特發性門靜脈高壓的肝臟匯管區內淋巴管數量與密度明顯增加，而且新生淋巴管數量和管腔面積與門靜脈周圍纖維化的嚴重程度呈正相關[25]。與病毒性肝病類似，非病毒引起的慢性肝病患者臟組織內淋巴管密度也明顯增加，并且與纖維化以及免疫細胞浸潤的區域有關[26]。VEGF/VEGFR-3信號通路是淋巴管發育及新生的主要途徑，肝纖維化的進展與肝細胞缺氧和脈管新生有關，而且肝臟中VEGF/VEGFR-3信號活化與微脈管的密度相關[27]。因此，現有證據表明淋巴管新生參與了肝纖維化的發生與發展。

3.2 Kupffer細胞在肝臟淋巴管新生中的作用 正常肝組織匯管區的淋巴管周圍分布有Kupffer細胞，而淋巴管新生的肝纖維化區域也分布有相當數量的Kupffer細胞，因此，推測肝臟淋巴新生與Kupffer細胞相關。在不同局部微環境狀態下，Kupffer細胞能夠極化成不同的亞型，即 M1型和 M2型。M1型Kupffer細胞分泌促炎細胞因子，維持促進炎癥發生、發展，產生活性氧誘導肝細胞凋亡，促進肝損傷的進展；M2型Kupffer細胞通過分泌IL-10 抑制炎癥的發生以及通過精氨酸酶1將精氨酸分解成聚胺，參與合成和穩定細胞外基質，對組織的修復產生作用，使慢性炎癥減輕[28]。極化的M1、M2巨噬細胞的表型在一定程度上可以在體內和體外逆轉，Kupffer細胞通過M1型和M2型的不同極化狀態影響肝臟的病理生理過程，Kupffer細胞持續的M1型極化促進了肝臟炎癥和纖維化的啟動及進展[29-30]。研究[31]表明，外源性VEGF-C可以通過調節炎癥反應以及Kupffer細胞的極化，從而緩解缺血再灌注導致的肝損傷；同時，Kupffer細胞除了分泌VEGF-C，通過VEGF-C/VEGFR-3通路促進淋巴管新生外[32]，還可通過包括自噬在內的方式轉分化為LyEC[33-34]，進而促進淋巴管新生。因此，Kupffer細胞通過不同的極化狀態、分泌VEGF-C以及轉分化為LyEC的形式參與肝臟淋巴管新生過程。但在肝纖維化過程中自噬將Kupffer細胞誘導為Ml還是M2型進而轉分化為LyEC的機制尚不明確。

3.3 LyEC調控肝纖維化的機制 肝臟中的淋巴系統除維持體液平衡外，在免疫調節中也起關鍵作用，作為構成淋巴管基本結構的LyEC則負責執行免疫調節功能。LyEC調節免疫的方式包括：(1)通過表達細胞因子和黏附分子介導免疫細胞遷移；(2)LyEC能直接降低樹突狀細胞的成熟度及阻止T淋巴細胞增殖，在免疫反應中起負調控作用；(3)LyEC還可以通過表達多種免疫調節因子如TGFβ和一氧化氮來實施負向免疫調節功能；(4)LyEC缺乏共刺激分子的表達，而富含共抑制標記，例如細胞程序性死亡-配體1[35]。值得注意的是，包括肝纖維化在內的慢性肝臟病變的肝臟內LyEC高表達趨化因子CCL21，說明淋巴管新生尤其是LyEC可能在慢性肝病肝纖維化進展中涉及免疫細胞遷移、歸巢等過程。

除了上述免疫調節功能外，LyEC還可以通過分泌功能參與肝纖維化過程。研究[3]發現，肝硬化大鼠體內LyEC通過上調內源性一氧化氮，引起以淋巴管平滑肌細胞覆蓋降低為主要特征的淋巴管重構，而抑制LyEC分泌的內源性一氧化氮合酶可以改善淋巴管重構。LyEC通過合成及分泌內源性一氧化氮合酶、內皮素參與了肝纖維化/肝硬化過程[36]，尤其是內皮素通過RhoA/Rock以及 PI3K/AKT信號通路引起HSC的收縮、遷移、增殖、活化，促進肝纖維化的發生、發展[37]。脂肪性肝炎終末期的肝纖維化過程中，LyEC還能夠分泌IL-13，除能直接促進肝纖維化外，可通過激活IL-13通路直接導致淋巴管Prox-1表達下降，引起淋巴管通透性增加，導致淋巴系統失平衡，從而參與肝纖維化過程[26]。

4 小結

總之，肝臟淋巴管新生與急慢性肝損傷、肝纖維化等病理狀態密切相關。急性肝損傷時，淋巴管新生通過介導免疫細胞的遷移以及免疫負調控功能減輕炎癥反應[1]；而當肝損傷因素持續并誘發肝纖維化及肝硬化時，淋巴管新生雖可以調節體液有助淋巴液回流，但持續的淋巴管新生與肝纖維化的進展相關。因此，淋巴管新生在肝病的不同階段對于機體的影響不同，即在炎癥起關鍵作用的肝病早期，增強淋巴管新生可以加速炎癥消退，阻止疾病進展；而在慢性肝纖維化階段，抑制淋巴管新生則可能是有益的。

目前，對淋巴管特異的分子標志物研究仍有限，而且缺乏有效的用于研究肝臟淋巴系統的體內體外模型和成像技術。此外，淋巴管新生在肝纖維化進程中的分子機制尚未完全清楚，有待進一步探討。但是，從淋巴管新生的角度研究干預肝纖維化進展的潛在靶點，對防治及逆轉肝纖維化甚至肝硬化，具有重要作用和意義。

作者貢獻聲明：石納負責資料分析、撰寫論文；陳修利、吳昊參與資料分析、修改論文；毛靖偉負責擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。