外泌體microRNA的生物學特征及在肝纖維化發生發展中的作用

張詩琬，喻雪琴，陳 芳，梅怡晗，梅小平

1 川北醫學院附屬醫院 感染科，四川 南充 637000； 2 首都醫科大學朝陽醫院 感染科，北京 610041

肝纖維化是肝組織炎癥反應發生后組織修復過程中細胞外基質過度沉積后的一種病理結果，其具體發生機制尚不明確，但纖維化的發生與肝星狀細胞(HSC)的激活、成纖維細胞與其他細胞間信息傳遞失衡關系密切，如與一氧化氮酶活性程度、轉化生長因子β(TGFβ)等細胞生長因子水平表達失衡等顯著相關。外泌體是通過細胞胞吐作用而釋放的一種膜性泡體，生物活性分子蛋白質、脂質及核酸等物質包裹在膜性泡體內，而且核酸內包含mRNA、microRNA(miRNA)等信息物質，在細胞間通過信號物質傳輸、信息傳導與交互來參與對靶細胞的各種生理與病理活動[1]。外泌體miRNA作為細胞間信號傳導的橋梁之一，研究表明，其對細胞外基質的形成與降解發揮了關鍵性的調節作用。作者認為，外泌體miRNA有可能成為未來肝纖維化診治的潛在新型生物學指標。本文就外泌體miRNA的形成與生物學特點及在肝纖維化發生機制中的作用做一綜述。

1 外泌體miRNA的形成與生物學特點

1.1 外泌體miRNA概述 來自于人體組織細胞可通過生物信號分子的傳導與漂移來介導細胞間交換，又稱細胞間通訊，是多細胞生物體信號交互的一種手段。細胞外囊泡作為一種重要的生物分子載體，在細胞通訊中起著非常重要的載體作用，可分為外泌體、微泡及凋亡小體三個亞群[2]。外泌體由科學家于1987年首次在綿羊網織紅細胞中發現并命名為“exosomes”[3]，其由細胞內多囊泡體形成，多經淋巴細胞、肝細胞、HSC、間充質干細胞等分泌釋放到人體的內環境中。Yez-M等[4]研究發現，在人體血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中均有外泌體miRNA等的表達與存在。細胞分泌的外泌體膜性囊泡內含mRNA、miRNA等生物活性分子，人體外周血中miRNA的主要信號分子來源就是外泌體[5]，外泌體通過將其內的miRNA等信號分子傳遞給其他細胞來完成細胞間的信號交換，從而調控靶器官或細胞內(間)的各種生理與生化活動。

1.2 外泌體的形成 機體細胞內的外泌體合成以細胞膜內陷內吞作用形成具有脂質雙分子層的內吞囊泡為起始步驟，隨后其核內胞膜再次發生內陷使之分隔成多腔內小囊泡，其特異性的內容物在重組與運轉蛋白作用下，選擇性地包裹胞內mRNA、miRNA、脂質等物質形成終末期內體，隨后終末期內體以內出芽模式形成管腔狀囊泡，即多囊泡體[6]，其細胞胞漿中miRNA等物質與一些跨膜分子蛋白進入囊泡內，囊泡膜隨之與胞膜融合，再次發生囊泡膜內陷形成顆粒囊泡，隨之顆粒囊泡分泌釋放至胞外形成外泌體[7]。信號蛋白Rab、GTP蛋白及下游信號分子GEF和GAP等一些小分子蛋白參與了外泌體的形成與分泌，多囊泡體通過微管驅動蛋白及動力蛋白來供給動力以發生漂移，Rab7與下游靶蛋白Alix和TSG101來調節多囊泡體的運動方向[8]。

外泌體通過胞吐作用將miRNA、mRNA等信號物質釋放至胞外并與靶細胞特異性融合，將其所含miRNA、mRNA等信號物質傳遞給靶細胞以此來調節靶細胞中的蛋白表達、免疫功能、細胞增殖、分化及凋亡等各種生理病理過程。靶細胞可通過以下三種模式來發揮信息交換與傳導：(1)外泌體膜上磷脂酰絲氨酸與活化的T淋巴細胞及巨噬細胞膜上的T1MI、TIM4等受體結合形成復合體，再與靶細胞膜上的整合素αvβ3、αvβ5結合；(2)靶細胞直接發揮內吞作用將外泌體吸收；(3)外泌體膜上特異性受體與靶細胞膜上相應配體結合，從而將內容物傳遞給靶細胞[9]。

多囊泡體內miRNA、mRNA等信號物質分泌釋放至細胞外被靶細胞吸收是多囊泡體在細胞內的去向之一。另外，胞內多囊泡體與溶酶體融合后的酸性水解酶可降解多囊泡體內的miRNA、mRNA等信號物質。最新研究[10]結果顯示，外泌體可以胞膜內出芽模式釋放到細胞外，也可以細胞內質膜連接隔室發生出芽而延緩釋放?？傊饷隗w的合成及釋放機制目前尚不明確，但可以肯定的是多囊泡體內miRNA、mRNA等信號物質可以外泌體形式釋放出細胞外，以外泌體為載體完成細胞間信息傳遞與交流，從而起到對疾病發生發展的調控作用。

1.3 外泌體的生物學特點 研究發現，外泌體作為一種細胞分泌釋放的微型小囊泡，內含miRNA、mRNA等信號物質，外泌體作為信號物質的載體，可通過配受體結合或細胞間直接接觸發生吞噬或融合作用,將mRNA、miRNA等信號物質傳遞出去，是實現細胞間信號物質與信息交流的重要載體。

由于來源于不同組織細胞的內含物不同，外泌體間存在不同種類，但都有相同的蛋白分子，如膜轉運蛋白、融合蛋白、熱休克蛋白、整合素與跨膜蛋白超家族中的CD9、CD63及CD81等。其中CD9及CD81作為外泌體特有蛋白分子，可作為外泌體特有的生物學標志物[11]。來源不同的外泌體miRNA功能差異較大[12]，如被病原菌感染過的細胞分泌的外泌體就包裹有病原體相關抗原；來源于T 、B淋巴細胞的外泌體，可表達T、B淋巴細胞相應的受體，并具有黏附受體的作用。相對應的，肝臟發生纖維化后，肝臟細胞分泌釋放的外泌體內就含有與肝纖維化發生密切相關的信號分子，如miRNA-122、miRNA-19a、miRNA-214等，并且在脂肪堆積的脂肪肝中，肝細胞受到脂肪酸損傷后會產生一種類外體小泡，其內含有miRNA-17-92，隨之被HSC內吞，進而發生肝纖維化[13]，通過對外泌體中miRNA、mRNA等信號物質的性質、活性及表達量的分析將對肝纖維化等疾病的發生機制與診治有重要的指導作用。

外泌體內容物所含核酸種類最多的是RNA，只有一些特定的RNA才會進入外泌體內從而被分泌，外泌體所含RNA與細胞中RNA差別較大，外泌體RNA一般不超過200個核苷酸[14]，主要由miRNA、mRNA、tRNA、lncRNA等非編碼核苷酸構成，這些外泌體所含RNA具有相應的調節功能，在被轉運到靶細胞后，可翻譯成蛋白質來發揮其特有功能，如外泌體所含特定miRNA被傳遞到靶細胞后，可通過修飾相應的靶miRNA來調節其相應基因的表達及功能。

外泌體是人體循環血中miRNA的主要來源，外泌體中miRNA在脂質雙分子膜保護下能夠不被RNA酶所降解，保持其在細胞、靶細胞與體內結構和功能的穩定性，使其在人體血液等體液中結構與表達水平能被穩定地檢出，不同病生狀態下循環血清中miRNA水平表達的差異性較大。因此外泌體中miRNA可能成為肝纖維化等疾病診治、預后評估等可靠的潛在新型生物學指標。

2 外泌體miRNA與肝纖維化

2.1 外泌體miRNA對肝纖維化發生的調節作用

2.1.1 外泌體miRNA對HSC的影響 有研究發現，外泌體miRNA相關基因表達與HSC活化、增殖、凋亡等生理活動密切相關。HSC是細胞外基質的主要來源，是肝纖維化發生發展的中心環節，miRNA可通過其信號傳導與物質轉導等途徑來調控靶細胞內相關肝纖維化基因的轉錄及水平表達，來源于外泌體內的miRNA對HSC激活、增殖、凋亡、漂移等生理過程有重要的調節作用，能誘導HSC的活化、增殖來促進肝纖維化的發生。

Seo等[15]研究發現，受損傷肝細胞可釋放眾多外泌體所有的自體RNA，并攜帶Toll樣受體3(TLR3)配體，能與HSC膜上的TLR3結合并誘導和促進HSC的激活、增殖，從而促進HSC表面的CC類趨化因子配體20(C-C motif chemokine ligand 20，CCL20)水平高表達，而CCL20可誘導高表達的CCR6+和γδT淋巴細胞聚集，抑制HSC凋亡，促進γδT淋巴細胞分泌大量的IL-17A，進而促進肝纖維化的形成。

Chen等[16]研究發現，HSC可分泌外泌體miRNA-214并在CCL20等趨化作用下黏附在附近的HSC或肝細胞膜上，促進同一細胞或不同細胞間信息傳導，其研究發現，肝組織發生纖維化時，促纖維化的結締組織生長因子(CCN2)水平高表達，這與低水平表達的miRNA-214呈負相關，提示miRNA-214對HSC的活化、增殖發揮了抑制作用，作者認為，通過外泌體miRNA-214與CCN2 3′-UTR的結合來抑制CCN2水平的表達，可下調其下游靶細胞基因表達。在肝組織纖維化時，HSC通過激活多條信號通路來下調miRNA-214水平表達，從而對CCN2的抑制作用減弱，因此，外泌體miRNA-214低水平表達可能是致肝纖維化發生的誘發因素之一。研究[17]發現，激活后的HSC可促進分泌釋放含轉錄調控因子Twist1外泌體的低水平表達，而Twist1可抑制miRNA-214的水平表達而減弱miRNA-214對CCN2的抑制作用，隨后受體細胞促進CCN2的表達水平上調，促進了α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及膠原蛋白水平高表達，誘導和促進了肝組織纖維化的發生發展[18]。

受損肝細胞、內皮細胞不僅參與HSC的活化，還參與了HSC的漂移過程，內皮細胞外泌體分泌鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase 1，SK1)，并通過纖連蛋白及整合素介導附著在HSC膜上，在動力蛋白2的作用下以內吞模式進入HSC內，從而激活HSC及與肝纖維化發生相關的AtK信號通路，外泌體miRNA的激活促進了致肝纖維化miRNA的漂移進而促進肝纖維化的發生[19]。而SK1的活化與成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)密切相關，有研究[20]結果顯示，FGF-2對外泌體miRNA的釋放有顯著的調節作用，SK1的靶蛋白是鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate，S1P)，高表達的SK1可促進S1P水平高表達而趨化HSC的聚集與活化，同時還激活絲氨酸/蘇氨酸激酶來調控HSC的活化、增殖與漂移能力，從而發揮對肝纖維化發生發展的調節作用。有學者[21]通過動物實驗發現，經過四氯化碳處理后發生肝纖維化的小鼠，其循環血中來源于外泌體的miRNA水平明顯上調，促進了HSC的活化、增殖及細胞外基質的形成，這可能與SK1/S1P有關，研究結果提示調控外泌體miRNA水平表達可能是抗肝纖維化治療的潛在手段和研究方向。

2.1.2 外泌體miRNA對肝纖維化標志物水平的影響 肝細胞受損后分泌釋放的外泌體miRNA可提高HSC活化以及增殖的標志性蛋白α-SMA、纖維化標志物TGFβ受體Ⅱ、Ⅰ型膠原蛋白α2的高表達，這與外泌體miRNA-17-92[22]等高表達關系密切。有研究[13]表明，在肝細胞受到脂肪酸侵害時，就會分泌釋放含有miRNA-17-92的囊泡小體，HSC可進行吞噬從而激活肝纖維化。同時抗纖維化的miRNA水平表達與肝細胞受損程度及修復后肝纖維化水平密切相關，如外泌體miRNA-122可增強肝組織再生基因絲裂原活化蛋白激酶及低氧誘導因子等的水平表達來參與肝組織纖維化的發生[23]。Devhare等[24]研究發現，HBV、HCV感染后的肝細胞會釋放一種外泌體(HCV-exo)促使HSC發生內吞作用以促進纖維化標志物水平升高，特別是miRNA-19a的高表達。肝細胞與HSC之間通過外泌體miRNA來實現細胞間信息介導和表達并調節肝纖維化的發生發展。

2.2 外泌體miRNA在肝纖維化診斷中的作用 外泌體與其他細胞膜接觸融合后將利用外泌體內的脂質雙分子層膜來保持miRNA結構與功能的穩定性，并傳遞到靶細胞內完成細胞間的信息交換，從而發揮對HSC活化、增殖的調節作用。Devhare等[24]研究發現，HCV感染后的肝細胞可釋放外泌體miRNA-19及靶向分子SOCS3至HSC膜上，并與相應受體結合后促進HSC的激活與增殖，且慢性HCV感染所致的肝纖維化患者血清中miRNA-19a水平較健康體檢者明顯升高。有學者認為，循環血清中外泌體miRNA-19a水平可能成為肝纖維化程度及預后評估的潛在新型生物學指標之一。研究發現，外泌體miRNA-214在活化的HSC中低表達，對CCN2抑制作用減弱導致其表達上調，CCN2水平不僅受到外泌體miRNA-214水平影響與調控，且CCN2可被外泌體包裹，由HSC釋放到體液中，介導HSC活化與信息傳導，提示外泌體miRNA-214及CCN2、Twist1等信息分子間相互作用對肝纖維化發生過程具有調控作用。外泌體miRNA在人體尿液、血液、腦脊液等體液中雖然表達微量但均可檢測，因此外泌體miRNA-214有望成為肝纖維化程度評估指標，可能成為一種新的肝纖維化診斷的非侵入性的潛在生物標志物。研究[13]表明，纖維細胞也可分泌釋放外泌體，且包含miRNA-21、miRNA-142a、miRNA-125b、miRNA-126、miRNA-130a以及miRNA-132等活性分子，這些活性物質對膠原纖維的產生有著促進作用，在人體組織損傷、傷口愈合的早期有利于膠原纖維的堆積，促進傷口愈合，因此在肝臟發生纖維化時，纖維細胞分泌的外泌體中這些信號分子的表達增高，可作為輔助診斷肝纖維化的生物學標志物。

2.3 外泌體miRNA對肝纖維化治療的影響 外泌體miRNA可通過各種途徑影響HSC活化與增殖，抑制HSC凋亡可促進肝纖維組織增生，但有研究發現，來源于干細胞的外泌體可通過抑制肝纖維化相關因子及信號通路來發揮抗肝纖維化作用。

Hyun等[25]研究發現，來源于絨毛膜板的間質干細胞外泌體miRNA-125b可通過抑制Hedghog信號通路來阻止肝纖維化發生。Li等[26]在研究四氯化碳與小鼠肝纖維化關系的實驗中發現，來源于人臍帶的間充質干細胞外泌體miRNA可通過抑制TGFβ/Smad信號通路、減弱p-Smad2水平表達來抑制α-SMA、細胞外基質合成以降低其表達，同時也抑制肝細胞上皮-間充質轉化過程，從而減輕肝細胞受損程度。Tan等[27]研究發現，來源于間充質干細胞的外泌體miRNA可通過上調細胞內蛋白質代謝周期及肝細胞中增殖細胞核抗原表達來提高肝細胞的增殖，促進肝細胞的再生和肝功能的修復。

有研究[28]表明，來源于脂肪組織的間充質干細胞(adipose tissue-derived mesenchymalstem cells，ADSCs)的外泌體miRNA可抑制TGFβ1的水平表達以調控肝纖維化的發生。由肝臟Kupffer細胞產生的TGFβ1，可促進HSC活化并誘導HSC增殖，活化的HSC可促進TGFβ1高表達，在成纖維細胞活化與增殖后可促進細胞外基質水平升高從而導致肝纖維化的發生。TGFβ1的啟動子有兩個State3結合位點，在活化的HSC中，激活后的State3可促進TGFβ1水平升高導致肝纖維化的發生。同時State3可通過MAPK/ERK信號通路上調Bcl-2的表達[29]，ADSCs來源的外泌體miRNA通過與靶細胞膜融合并向靶細胞傳遞信號后下調HSC中State3及Bcl-2水平表達，從而使TGFβ1水平下調，抑制HSC活化與增殖，外泌體miRNA下調下游靶基因TGFβ1水平來抑制TIMP-1和PAI-1等信號通路活性，從而抑制膠原蛋白、α-SMA、纖維黏連蛋白合成與水平表達，發揮抗肝纖維化作用[28]。Nong等[30]研究發現，來源于間充質干細胞的外泌體miRNA對大鼠肝缺血再灌注后的炎癥反應及氧化應激反應可起到明顯的抑制作用，減輕了肝臟再灌注后的損傷程度。

肝組織受損后，不同細胞來源的外泌體miRNA通過各種途徑來促進肝纖維化的發生，同時肝纖維化過程也受到外泌體miRNA的抑制作用，減輕肝組織的纖維化進展，這可能與HSC的活化、增殖及細胞外基質形成關系密切。上文提到CCN2是一種對HSC活化、增殖、遷移起著重要作用的促纖維化活性因子，其表現出非?；钴S的成纖維細胞特性，促進了細胞外基質的沉積，加速了肝纖維化進程。miRNA-214與CCN2呈負相關，靜止型HSC會釋放出一種抑制HSC活化及纖維生成的外泌體，這些外泌體將miRNA-214、miRNA-199a-5p以及Twist1傳遞給受體HSC，直接抑制CCN2的轉錄，從而抑制下游靶基因的表達，膠原纖維生成受阻，并且使活化的HSC恢復到更安靜的表型[13]。由此可見，外泌體miRNA將來可能被用于肝纖維化的治療，也許會成為肝纖維化診治和預后評估的新指標。

總之，外泌體miRNA作為一種新型信息分子，現已發現有2838 種miRNA和3408種mRNA，其在肝纖維化中的表達變化及其與肝纖維化的關系和作用機制尚不清楚。外泌體miRNA對肝纖維化過程中炎性反應、HSC活化、增殖與凋亡、細胞外基質沉積都有明顯抑制與促進的雙重作用。外泌體miRNA在人體體液中易被穩定檢出，因此其可能作為肝纖維化程度、診斷及預后評估的新型生物學標志物。但目前對外泌體miRNA在肝纖維化發生機制中作用的研究較少，能特異性反映肝組織纖維化的外泌體miRNA也較少，未來還需要更多的加強基礎研究與臨床應用驗證。來源于干細胞的外泌體miRNA可對肝纖維化進程產生抑制作用，減輕肝組織炎癥，促進肝組織炎癥及功能恢復，作者認為，干細胞源性的外泌體miRNA在肝纖維化治療方面有較好的研究前景，可能成為未來抗肝纖維化治療的潛在新靶點。