高通量測序分析黑土稀有微生物群落結(jié)構(gòu)

關(guān)健飛 曹陽

摘要：稀有微生物群落作為地球生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著超比例的角色。以黑龍江省黑土中稀有微生物為研究對象，采用高通量測序技術(shù)分析黑土中稀有細菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成及其與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性。對屬水平上稀有微生物群落進行分析發(fā)現(xiàn)，相對豐度在0.01%以下的稀有細菌菌屬420種，稀有真菌菌屬210種，各采樣點處稀有微生物類群分布差異性較大，存在特征稀有微生物類群，但未見黑土共有稀有菌屬的檢出。總磷和有效磷的含量分別影響不同種類的稀有細菌菌屬，其中放線孢菌屬（Actinomycetospora）與總磷含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，無色桿菌屬（Achromobacter）與有效磷含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系。真菌稀有菌群中的小孢霉屬（Microbotryum）、頂孢霉屬（Acremonium）等與土壤含水率、有機質(zhì)含量、總氮含量、硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：稀有微生物;群落結(jié)構(gòu);高通量測序;黑土;理化性質(zhì)

中圖分類號： S154.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0288-05

微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能和服務(wù)過程中起著關(guān)鍵作用[1]。現(xiàn)階段對于土壤微生物的研究主要集中在物種組成、結(jié)構(gòu)功能以及遺傳多樣性等方面。土壤中的微生物群落具有典型的物種豐度分布偏斜特征，表現(xiàn)為相對高豐度的少量優(yōu)勢物種與相對低豐度的大量稀有物種共存[2]，稀有群落作為地球生態(tài)系統(tǒng)中至關(guān)重要的組成部分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著超比例的角色[3]，是微生物群落功能的一個潛在驅(qū)動力[4]，稀有微生物群落是評價微生物多樣性的重要因素，是微生物遺傳和功能多樣性的存儲庫，具有驅(qū)動地球化學(xué)循環(huán)[5-6]、指示環(huán)境變化[7-8]、降解污染物[9-10]、穩(wěn)定群落結(jié)構(gòu)[11]等重要功能。然而相對于優(yōu)勢類群，現(xiàn)階段對于稀有微生物類群的研究較少[12]。本研究以黑龍江省黑土為研究對象，解析土壤中稀有細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成，分析稀有微生物群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，為稀有微生物的生態(tài)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

本研究以黑龍江省表層（0～20 cm）黑土為研究對象，在黑龍江省區(qū)域內(nèi)設(shè)置10個采樣點（圖1），于2019年5月進行土壤樣品采集。土壤樣品采集過程中去除細根等雜物后，充分混勻，置于密封袋，帶回實驗室后，-80 ℃保存土壤樣品用于高通量測試分析，常溫風(fēng)干土壤樣品用于理化性質(zhì)測定。

1.2 高通量測序

采用Illumina MiSeq測序平臺對測序樣本進行雙端測序，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測序過程中，采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤總DNA。采用細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對高變區(qū)片段進行擴增，PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min;27次循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s）;72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。20 μL反應(yīng)體系為4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL的Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL的Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL的FastPfu Polymerase，0.2 μL的BSA，10 ng的Template DNA，補ddH2O至20 μL。真菌18S rDNA的V5-V7區(qū)引物SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）對高變區(qū)片段進行擴增，PCR反應(yīng)條件為90 ℃預(yù)變性3 min;37次循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）;72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。20 μL反應(yīng)體系為 4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL的Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL 的Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL的FastPfu Polymerase，0.2 μL的BSA，10 ng的Template DNA，補ddH2O至20 μL。利用QuantiFluorTM-ST微型熒光計進行PCR產(chǎn)物檢測定量。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過barcode拆分后獲得的有效序列信息統(tǒng)計，使用Qiime2軟件中的DADA2插件對所有樣品的全部原始序列進行質(zhì)量控制、去噪、拼接并且去嵌合體，形成OTU。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水率的測定采用真空烘箱法;pH值的測定采用電位法;有機質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀滴定法;全氮含量的測定采用半微量開氏法;全磷含量的測定采用氫氧化鈉堿融-鉬銻抗比色法;全鉀含量的測定則采用火焰光度法;硝態(tài)氮含量采用連續(xù)流動分析儀法進行測定;有效磷含量采用鉬銻抗比色法進行測定，其中酸性土壤使用氟化銨-鹽酸作為浸提劑，堿性土壤使用碳酸氫鈉作為浸提劑;速效鉀含量則使用乙酸銨浸提-火焰光度計測定，每個土壤樣品測3次取平均值記錄，用于后續(xù)試驗數(shù)據(jù)的分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

選取代表性O(shè)TU序列，與核糖體RNA數(shù)據(jù)庫（Greengenes Database 13_8版本[按99%序列相似性聚類]）進行比對獲得物種注釋信息。使用Excel 2010、Origin 8.0對數(shù)據(jù)進行處理以及作圖分析，使用SPSS 19.0進行土壤理化性質(zhì)和稀有細菌、真菌菌群的Pearson相關(guān)性分析以及各采樣點的細菌、真菌聚類分析，本研究中細菌和真菌菌屬稀有性的定義為小于0.01%的相對豐度[13]。

[4]Jousset A，Bienhold C，Chatzinotas A，et al. Where less may be more：how the rare biosphere pulls ecosystems strings[J]. ISME Journal，2017，11（4）：853-862.

[5]Zhang Y，Dong S K，Gao Q Z，et al. “Rare biosphere” plays important roles in regulating soil available nitrogen and plant biomass in alpine grassland ecosystems under climate changes[J]. Agriculture Ecosystems & Environment，2019，279：187-193.

[6]Philippot L，Spor A，Hénault C，et al. Loss in microbial diversity affects nitrogen cycling in soil[J]. The ISME Journal，2013，7（8）：1609-1619.

[7]Jiao C C，Zhao D Y，Huang R，et al. Abundant and rare bacterioplankton in freshwater lakes subjected to different levels of tourism disturbances[J]. Water，2018，10（8）：1075.

[8]Wang Y Q，Hatt J K，Tsementzi D，et al. Quantifying the importance of the rare biosphere for microbial community response to organic pollutants in a freshwater ecosystem[J]. Applied and Environmental Microbiology，2017，83（8）：e03321-16.

[9]Wei S T S，Wu Y W，Lee T H，et al. Microbial functional responses to cholesterol catabolism in denitrifying sludge[J]. mSystems，2018，3（5）：e00113-e00118.

[10]Giebler J，Wick L Y，Chatzinotas A，et al. Alkane-degrading bacteria at the soil-litter interface：comparing isolates with T-RFLP-based community profiles[J]. FEMS Microbiology Ecology，2013，86（1）：45-58.

[11]Vivant A L，Garmyn D，Maron P A，et al. Microbial diversity and structure are drivers of the biological barrier effect against Listeria monocytogenes in soil[J]. PLoS One，2013，8（10）：e76991.

[12]Lynch M D J，Neufeld J D. Ecology and exploration of the rare biosphere[J]. Nature Reviews Microbiology，2015，13（4）：217-229.

[13]Galand P E，Casamayor E O，Kirchman D L，et al. Ecology of the rare microbial biosphere of the Arctic Ocean[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（52）：22427-22432.

[14]Musat N，Halm H，Winterholler B，et al. A single-cell view on the ecophysiology of anaerobic phototrophic bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（46）：17861-17866.

[15]Liu M，Xue Y Y，Yang J. Rare plankton subcommunities are far more affected by DNA extraction kits than abundant plankton[J]. Frontiers in Microbiology，2019，10：454.

[16]Hu B Y，Xu B X，Yun J L，et al. High-throughput single-cell cultivation reveals the underexplored rare biosphere in deep-sea sediments along the Southwest Indian Ridge[J]. Lab on a Chip，2020，20：363-372.

[17]Hamasaki K，Taniguchi A，Tada Y，et al. Active populations of rare microbes in oceanic environments as revealed by bromodeoxyuridine incorporation and 454 tag sequencing[J]. Gene，2016，576（2）：650-656.

[18]Podar M，Abulencia C B，Walcher M，et al. Targeted access to the genomes of low-abundance organisms in complex microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（10）：3205-3214.

[19]Zhou Q，Zhang X M，He R J，et al. The composition and assembly of bacterial communities across the rhizosphere and phyllosphere compartments of Phragmites australis[J]. Diversity，2019，11（6）：98.

[20]Ai D X C，Chu C J，Ellwood M D F，et al. Migration and niche partitioning simultaneously increase species richness and rarity[J]. Ecological Modelling，2013，258：33-39.

[21]Gaston K J. Biodiversity and extinction：the importance of being common[J]. Progress in Physical Geography，2008，32（1）：73-79.

[22]Rodrigues J L，Pellizari V H，Mueller R，et al. Conversion of the Amazon rainforest to agriculture results in biotic homogenization of soil bacterial communities[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（3）：988-993.

[23]Chambers L G，Guevara R，Boyer J N，et al. Effects of salinity and inundation on microbial community structure and function in a mangrove peat soil[J]. Wetlands，2016，36：361-371.

[24]Roesch L F W，F(xiàn)ulthorpe R R，Riva A，et al. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity[J]. ISME Journal，2007，1（4）：283-290.關(guān)添澤，于 萌，盧 剛，等. 基于分形維數(shù)的不同發(fā)育階段胡楊對土壤理化性質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：293-300.