補腎安胎顆粒的質量標準研究

熊青，陳勝輝，李恒

江西中醫藥大學附屬生殖醫院，南昌 330004

補腎安胎顆粒是江西中醫藥大學附屬生殖醫院臨床經驗方，由黨參、槲寄生、炒白芍、枸杞子、續斷、杜仲、淫羊藿、白術、熟地黃、仙茅、炙甘草等11味中藥飲片加工制成，具有補腎養胎、健脾養血之功效，臨床用于腎虛型黃體功能不足引起先兆流產和實施輔助生殖技術后的助孕安胎治療。補腎安胎顆粒為醫院制劑，尚無有效的質控標準，本文采用薄層色譜（TLC）法對補腎安胎顆粒中的枸杞子、川續斷、赤芍、淫羊藿和甘草進行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對補腎安胎顆粒中的芍藥苷進行定量分析，為有效控制補腎安胎顆粒質量提供標準。

1 材料

1.1 儀器

LC-10ATvp島津高效液相色譜儀，SCL-10ATvp檢測器；KQ-400DE型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；TW20水浴鍋（德國Julabo公司）。

1.2 樣品與試劑

補腎安胎顆粒（自制，批號：20180401、20180402、20180403）；川續斷皂苷Ⅵ（111685-201707）、芍藥苷（110736-201741）、淫羊藿苷（110737-201516）、黨參炔苷（111732-201607）、甘草苷（111610-201607）齊墩果酸（110709-201808）、毛蕊花糖苷（111530-201713）等對照品，枸杞子（121072-201611）、杜仲（121202-201103）、白術（120925-201611）、熟地黃（121196-201406）等對照藥材，均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠GF254板（青島海洋化工廠，批號：20070927）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 補腎安胎顆粒的制備

取組方的11味中藥飲片，加5倍量水進行煎煮，每次煎煮時間為1 h，共煎煮2次，將煎液合并后給予濾過處理，隨后濃縮濾液呈稠膏，稠膏相對密度為1.20～1.25（60 ℃），70 ℃減壓干燥，粉碎，加入甜菊素、糊精適量，混勻，制粒，干燥，制成顆粒，即得。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 枸杞子的薄層鑒別供試品溶液：取適量補腎安胎顆粒，研細，稱取4 g，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。

對照藥材溶液：取枸杞子對照藥材0.5 g，加水35 mL，煎煮至微沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得對照藥材溶液。

缺枸杞子陰性溶液：取適量缺枸杞子陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

照薄層色譜法試驗：吸取供試品溶液5 μL、缺枸杞子陰性溶液5 μL、對照藥材溶液5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1）作為展開劑，經展開，取出，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，對照藥材色譜與供試品色譜相應位置上顯示相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。結果見圖1。

2.2.2 續斷的薄層鑒別供試品溶液的制備：取適量補腎安胎顆粒，研缽研細，精密稱取4 g，加甲醇40 mL超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水約20 mL使溶解，通過已處理好的D101型大孔吸附樹脂柱(內徑為1 cm，柱高為15 cm)，依次以水、30%乙醇、50%乙醇各100 mL洗脫，棄去，再以70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備：取川續斷皂苷Ⅵ對照品，加入甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即為對照品溶液。

缺續斷陰性溶液的制備：取適量缺續斷陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

照薄層色譜法試驗：吸取供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL、缺續斷陰性溶液10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，選取正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）上層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖2。

由圖可見，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

2.2.3 炒白芍的薄層鑒別供試品溶液的制備：取補腎安胎顆粒適量，研缽研細，精密稱取粉末4 g，加甲醇40 mL超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加20 mL水使溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

缺炒白芍陰性溶液的制備：取缺炒白芍陰性樣品適量，照供試品溶液的制備方法同法制成缺炒白芍陰性溶液。

照薄層色譜法試驗吸取上述供試品溶液、缺炒白芍陰性溶液15 μL、對照品溶液5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖3。

由圖可見，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

2.2.4 淫羊藿苷的薄層鑒別供試品溶液的制備：同枸杞子的薄層鑒別試驗中供試品溶液的制備方法。

對照品溶液的制備：取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

缺淫羊藿陰性溶液的制備：取缺淫羊藿陰性樣品適量，照供試品溶液的制備方法同法制成缺淫羊藿陰性溶液。

照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10 μL，點于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105 ℃加熱數分鐘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果見圖4。

由圖可見，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

2.2.5 炙甘草的薄層鑒別供試品溶液的制備：取補腎安胎顆粒適量，研缽研細，精密稱取粉末4 g，加水20 mL使溶解，離心，取上清液，通過D101型大孔吸附樹脂柱（柱長12 cm，柱內徑約1 cm，濕法裝柱，用水50 mL預洗），用水洗至洗脫液近無色，再用60%乙醇30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液。

甘草苷對照品溶液的制備：另取甘草苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

缺炙甘草陰性溶液的制備：取缺炙甘草陰性樣品適量，照供試品溶液的制備方法同法制成缺甘草陰性溶液。

照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱數分，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果見圖5。

由圖可見，對照品色譜與供試品色譜相應位置上顯示相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

2.3 HPLC法測定補腎安胎顆粒中芍藥苷的含量

2.3.1 溶液的制備對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取裝量差異項下的內容物研細，取約1.5 g，精密稱定，加稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，以稀乙醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

缺炒白芍陰性溶液的制備：取缺炒白芍陰性樣品適量，照“供試品溶液的制備”方法制備，即得。

2.3.2 色譜條件Diamonsil C18柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（14∶86）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為：230 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

2.3.3 系統適用性試驗分別精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液和缺炒白芍陰性溶液，按“2.3.2”項下色譜條件進樣測試。芍藥苷保留時間約在9 min，與其它各峰達到基線分離，且陰性無干擾，理論塔板數按芍藥苷峰計為3 000以上。色譜圖見圖6。

2.3.4 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液（芍藥苷濃度為24.36 μg/mL）30、20、10、8、5、2 μL，注入液相色譜儀中，記錄相應色譜圖，橫坐標為芍藥苷進樣量，縱坐標為峰面積，據此繪制標準曲線，得回歸方程：Y=125 383.360X-5 498.209 0，R2=0.999 9。結果表明，芍藥苷在0.048 96～0.730 80 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.3.5 精密度與重復性試驗取芍藥苷對照品溶液，連續進樣6次，RSD為1.83 %；取批號20180402的補腎安胎顆粒樣品6份，依法測定，RSD為0.93 %，本法精密度和重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗取對照品溶液、供試品溶液，按樣品測定項下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h后依法測定，RSD分別為1.69%和1.24%，結果表明，對照品溶液和供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗取已知含量的補腎安胎顆粒6份，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品溶液1 mL（每mL含芍藥苷0.675 6 mg），參照供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品溶液，并依法進行測定，計算溶液回收率，平均回收率分別為100%、50%、99.96%、98.89%、99.45%、101.08%、100.37%，RSD為0.78%，本法回收率良好。

2.3.8 含量測定和限度取批號20180401、20180402、20180403樣品測定芍藥苷的含量，芍藥苷含量分別為11.6、11.5、11.5 mg/袋（每袋12 g）。

《中國藥典》2020年版一部炒白芍項下規定：水分不得過10.0%，含量按干燥品計算，含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.2%。本品每1袋中含炒白芍1.668 g，芍藥苷的轉移率約為45%。考慮到大生產環節中的損耗等因素，以40%轉移率計算，本品每袋含芍藥苷為7.2 mg。故擬將本制劑含量限度定為：本品每袋含炒白芍以芍藥苷（C23H28O11）計，不得少于7.2 mg。三批樣品的含量均符合規定。

3 討論

3.1 含量測定指標的選擇

本制劑君藥為黨參、槲寄生。黨參藥材標準《中國藥典》2020年版一部［12］收載，該標準中僅有浸出物的測定，未收載含量測定方法，由于未有適宜的含量測定指標，故暫未建立黨參的含量測定方法。槲寄生藥材標準《中國藥典》2020年版一部收載，該標準中測定紫丁香苷的含量，含量限度為按干燥品計算，含紫丁香苷（C17H24O9）不得少于0.04%。以該限度計算，本制劑中紫丁香苷的含量低于萬分之一，不適宜作為本制劑的含量測定指標。白芍具有養血調經的功效，為本制劑的臣藥之一，芍藥苷為炒白芍中的有效成分，故擬將芍藥苷作為本品的含量指標。參照2020年版《中國藥典》中白芍項下含量測定方法，采用HPLC法測定本品中芍藥苷的含量。

3.2 含量測定波長的選擇參考相關研究方法［13-18］，在230 nm波長處芍藥苷有較強的吸收，選擇230 nm作為測定波長建立了HPLC法測定補腎安胎顆粒中芍藥苷的含量測定方法，結果顯示峰形對稱，分離度良好。

綜上所述，本試驗建立的TLC法專屬性強、斑點清晰，陰性對照無干擾。同時測定補腎安胎顆粒中芍藥苷含量的HPLC法，準確性好、靈敏度高，可以作為補腎安胎顆粒的質量控制手段之一。