影響食用菌菌種質量的因素及提高菌種質量的方法

岳萬松，華 蓉，劉紹雄，李雪松，楊珍福，羅孝坤

(1.云南省供銷合作社科學研究所，昆明 650221；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，昆明 650221)

我國是食用菌生產大國，據中國食用菌協會統計[1]，2018年全國食用菌總產量多達3 842.04萬t，產值達2 937.37億元。國內現有可栽培的食藥用菌達105余種，種類結構不斷優化，近年來食用菌產業不斷發展壯大，已成為國內多個貧苦地區助推鄉村振興一個重要的支柱產業[2]。菌種是食用菌栽培生產過程的源頭，其質量直接影響食用菌的產量和品質，在食用菌的栽培生產中，即便是采用優質食用菌品種生產，也會因人為造成的不良生長條件、傳代次數、菌種菌齡、無菌操作水平等因素，導致菌種出現雜菌感染、老化甚至種性退化問題，具體表現為菌絲生長緩慢、長勢細弱稀疏、菌種培養周期長、抗雜能力差、后續不易出菇或出菇后子實體農藝性狀變差等，嚴重影響食用菌生產的穩定性和均一性，阻礙了食用菌產業的健康發展，給食用菌生產企業造成巨大的經濟損失。這已成為食用菌產業健康發展中不可忽視的問題[3]。

1 影響食用菌菌種質量的因素

食用菌菌種相當于其它作物生產中的種子，其質量主要受食用菌自身的遺傳特性、外界的生長條件及人為操作等幾個因素所控制。內部因素主要是由菌種自身的遺傳特性所決定，外界因素主要包括營養條件(培養基配方及其成分配比、酸堿度及含水量等)和培養條件(溫濕度、通風、光照等)。

1.1 遺傳因素

遺傳物質是影響食用菌菌種質量的最重要因素之一。李亞嬌等[4]認為，在食用菌生長過程中，會出現菌種異核現象，這可能會導致菌種發生遺傳變異(核型改變)。譚琦等[5]通過實驗印證了這個假設，退化的蛹蟲草菌株為同核體交配型基因，不能形成子實體，而未變異菌株則為異核體交配型基因。李美娜等[6]等利用分子生物學的方法分別分析了蛹蟲草野生馴化菌株和退化菌株，結果發現二者基因存在明顯差異。胡鋒黎等[7]探討草菇細胞核不對稱分裂與菌種退化的相關性，結果表明，草菇細胞核不對稱分裂可能是引起其菌種退化的一個重要遺傳因素。

1.2 生長條件

1.2.1營養因素

外界因素特別是營養成分會影響真菌異核體核的配比和分解，在菌種培養過程中出現營養不良時，比如培養基不適合菌株生長，培養料碳氮比不合理將會導致菌株的遺傳物質合成受阻，影響菌絲生長速度及生長勢[8-11]，最終導致栽培出菇的子實體農藝性狀及品質變差[12,13]。在菌種發菌過程中，菌絲需分泌木質素酶、纖維素酶、漆酶等分解酶才能分解利用培養基質，而這些分解酶的活性由培養料的pH值所左右，不同種類食用菌對pH值要求也不同，過酸或過堿均會影響酶活性，導致新陳代謝減慢或停止[14]。黃敏敏等探究了酸堿度對菌絲生長發育的影響，結果表明，pH對菌絲直徑及鎖狀聯合的數量及表面結構有一定的影響[15]。另外，培養料含水量過低，菌絲因缺少水為介質，對培養基的降解能力減弱；培養料含水量過高，受重力作用，菌袋(瓶)下部份水分偏大，透氣性低，菌絲會缺氧導致呼吸作用下降，菌絲偏弱，營養生長不良[16]。綜上，培養基狀況包括培養基配方及其成分配比、酸堿度、含水量等都是影響菌類菌種生長繁殖的重要因素。

1.2.2培養環境

人為造成的不良環境條件，如高溫、高濕、通風不良、強光等也是影響菌種質量的因素[16]。食用菌作為一種大型真菌，其細胞被緊密的細胞壁包圍，以保護它們不受有害環境條件的影響并抵抗溶解，高溫是一種重要的非生物脅迫，會破壞菌絲細胞的結構完整性、影響菌絲的抗雜能力，有研究表明，平菇菌絲在36 ℃高溫脅迫下，菌絲細胞壁結構趨于收縮或扭曲，細胞壁空隙率增加，經高溫處理后的平菇菌絲抗逆性變差，更易受到木霉菌的感染[17]。食用菌在營養生長階段需要充足的氧氣和適宜的濕度。劉秀明等[18]以刺芹側耳為材料，探究高溫脅迫對其菌絲生長及其抗棘孢木霉能力的影響，試驗發現供試PDA培養的菌絲經高溫脅迫后，頂端菌絲細胞長度、直徑、菌絲體分支頻率和菌絲生長速率等均呈現不同程度的降低。長滿菌絲的菌棒經高溫脅迫(35 ℃，7 d)后，接種棘孢木霉菌絲的侵染率為100%，接種棘孢木霉孢子的侵染率為30%；未經高溫脅迫的菌棒，接種棘孢木霉菌絲/孢子，未發生侵染，可見高溫脅迫導致刺芹側耳菌絲抗棘孢木霉的侵染能力明顯下降。另外，高溫高濕環境容易造成培養室滋生各種霉菌，與培養菌株爭奪營養，導致菌種不純；或者侵染菌株，導致菌絲無法繼續生長發育[19]。食用菌菌絲從營養階段向生殖階段轉變時需要一定的光照，光不僅能調控菌類生理周期、形態變化和代謝產物，還能促進菌類原基分化和子實體生長，但是目前普遍認為多數菌類的菌種培養階段(營養生長階段)不需要光誘導，若培養環境光線過強，反而會抑制食用菌的無性生長[20]。藍光抑制平菇菌絲生長，強光對茶樹菇和鳳尾菇的菌絲生長不利，并且會導致菌種發菌還未完成就現蕾出菇的現象[21,22]。

1.3 其它因素

菌種菌齡。菌齡過大引起菌種出現老化或自溶現象，這類問題在食用菌液體菌種培養中尤為突出，液體菌種單次培養時間一般在5～7 d，培養好后要緊接著使用，若培養時間過長，則容易導致菌絲分泌的多種酶的活性降低[23]，并產生一些阻礙菌絲生長發育的有害物質，導致菌絲細胞衰老破裂[24]。固體菌種菌齡太長，同樣會出現菌種萌發能力下降，菌絲細胞脹大、細胞壁變形等菌種老化現象。王博[25]通過試驗證明，接種菌齡30 d與接種菌齡150 d的試管菌種到平皿培養基中，二者相比，前者的菌絲生長速度(1.8 cm/d)、萌發時間(1.5 d)明顯優于后者菌絲生長速度(0.96 cm/d)、萌發時間(5 d)；雙孢蘑菇菌種在培養50～60 d后開始老化，且菌齡與老化程度呈正相關，最終菌絲細胞壁膨脹甚至破裂瓦解。李利梅[26]研究分析了菌齡對紅托竹蓀菌種菌絲生長發育的影響，試驗表明，漆酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶活性隨菌齡的增大而明顯下降，菌絲萌發力及生長速度隨著菌齡增大而明顯下降，菌齡90 d時，菌絲完全溶解，塌陷形成老化菌皮。

病原體侵染性病害。培養基滅菌不徹底，接種室、培養室在使用前消毒殺菌不徹底，無菌操作技術不熟練等人為因素都會造成接種后的菌種感染雜菌[27]，深綠木霉、侵占木霉、病毒、細菌等病原體，導致菌絲體無法繼續生長發育，輕微時會導致菌絲生長速度變慢、菌落形狀不規則，局部伴有缺刻或菌絲紊亂等；嚴重時則出現萎縮、褪菌和凋亡等現象[28-30]。

2 提高食用菌菌種質量的處理方法

2.1 創造適宜的生長條件

2.1.1適宜的營養條件

根據食用菌的生產方式及其質量控制的需要，我國食用菌菌種實行一級種(母種)、二級種(原種)和三級種(栽培種)的三級繁育體系[31]。提供和滿足菌類生長發育的營養需求是保證菌種質量的前提，選用合適的培養基才能最大限度地保證菌絲進行正常的代謝活動，避免遺傳物質合成受阻，進而導致種性退化。碳源和氮源是食用菌培養基最主要的兩個成分，其中，碳源是主料，生產中常用葡萄糖、蔗糖、淀粉、木屑、棉籽殼、玉米芯、稻草、農作物秸稈等。氮源是輔料，生產中常用蛋白胨、酵母粉、麥麩、黃豆粉等。通過添加石膏、石灰、磷酸二氫鉀、硫酸鎂可補充礦質營養。一般使用常規的PDA培養基即可完成多數菌類的母種擴繁[16]。原種與栽培種的配方一般類似，可使用多種培養基制作，在實際生產中，適合側耳屬菌類、金針菇、猴頭菇、黑木耳、香菇等多數木腐菌生長的原種/栽培種培養基有棉籽殼培養基、木屑培養基、棉籽殼木屑培養基、棉籽殼玉米芯培養基、枝條培養基或膠囊菌種等[32-38]；適合雙孢蘑菇、草菇、大球蓋菇等多數草腐菌生長的原種/栽培種培養基有谷粒培養基、糞草培養基、稻草培養基、秸稈培養基等[39-42]。近年來新興的液體菌種具有活力高、萌發快、菌齡一致、培養周期短等優點，在多數菌類的原種制作中均得到了廣泛應用[43-45]。

不同菇種的生物學特性一般不同，在進行人工培養菌種時，需要根據栽培菇種的特性，將培養基碳氮比、酸堿度及含水量等控制在特定范圍內，才能對食用菌菌絲及子實體的生長發育有積極的促進作用。張一帆探討了栽培配方的碳氮比與灰樹花菌絲體生長的相關性，結果表明，灰樹花菌絲的生長速度與碳氮比呈正相關，碳氮比71.39∶1時，菌絲生長最快[9]。王慶武等對黑木耳菌絲培養特性進行了研究，結果表明在pH值為6～7，碳氮組合為玉米粉1%，葡萄糖2%，酵母膏0.1%，牛肉膏0.4%時，菌絲生長快，長勢好[46]。

2.1.2適宜的培養環境

溫度是對食用菌生長發育影響最活躍、最重要的因素之一，尤其是高溫，對菌絲的生長速度、細胞結構、抗感染能力及酶活性有明顯影響。不同種類食用菌、同一種類不同品種在菌絲生長階段所需的溫度有所不同，在實際生產中，應根據所生產食用菌的生物學特性將菌絲培養溫度控制在適宜范圍內。綜合前人對菌絲培養溫度的研究結果[47-50]，可以將食用菌菌絲生長溫度分為3種溫型，分別是：Ⅰ類，菌絲生長最適溫度范圍30～37 ℃，代表類型僅有草菇；Ⅱ類，菌絲生長最適溫度范圍25～30 ℃，代表類型有側耳屬多數菌類、黑木耳、毛木耳、茶樹菇、姬松茸、虎奶菇、鮑魚菇、靈芝、竹蓀、灰樹花等等；Ⅲ類，菌絲生長最適溫度范圍20～25 ℃，代表類型有金針菇、雙孢蘑菇、金耳、猴頭菇、白靈菇等等。

食用菌菌絲生長階段對水分和通風有其特定要求，培養料含水量宜控制在60%～65%，若含水量過高且通風不足，則會導致缺氧，呼吸作用減弱，菌絲生長發育緩慢或者異常。空氣相對濕度不宜過高(不超過70%)，否則容易引起培養環境滋生各種霉菌，進而感染菌種，導致菌種不純[51]。

此外，菌種培養階段應盡量避免太陽光直射，雖有研究表明，鳳尾菇、靈芝、香菇等菌類的菌絲在白光或者較弱的散射光下能較好地生長[20-22,52]，但多數菌類的菌絲在黑暗條件下生長更好，強光抑制菌絲體生長，最好遮光培養。

2.2 適宜的菌種保藏方法

適宜的保藏方法對保持食用菌菌種活力及保存菌種優良性狀都有極其重要的作用。原種及栽培種都是成批量生產，數量多、體積大，很難放于冰箱保存。菌齡是影響菌種的活力重要因素，菌齡過大，菌絲易老化，嚴重時會產生自溶現象[19]。一般生產出來要緊接著使用，原則上不超過1個月，只能作短期保藏。

為了較長時間保持菌種在遺傳、形態和生理、種性上的穩定性，常采用控制溫度、營養、氧氣、水分等因素的方法，抑制食用菌母種的菌絲新陳代謝活動，從而最大限度地保存菌種的性狀并延長保藏時間。生產中母種常用的保藏方法有斜面低溫保藏法、-80 ℃低溫保藏法、液氮超低溫保藏法、液體石蠟保藏法、蒸餾水保藏法、冷凍真空干燥法等等[53-54]。綜合保藏后菌種酶活性及萌發生長情況，在實際生產中，斜面低溫保藏法適合各菌類的短長期(3～12個月)保藏，成本相對較低，但需要定期更換培養基轉管后再冷藏，操作繁瑣[55-57]；液氮超低溫保藏法適合大部分菌類的長期(1～10年)保藏，流程簡便，但成本相對較高[58-60]。除上述保藏方法外，也有學者利用自然基質(如木屑)結合冰箱冷藏的方式保藏食用菌菌種，對金針菇、黑木耳、香菇、猴頭菇、靈芝、茯苓等菌類的菌種保藏效果非常顯著，具有保藏時間長(1～8年)、方法簡便、原料易取、不需要特殊設備的優點[61,62]。

2.3 控制菌種傳代次數

在食用菌菌種生產中，需要對菌種進行母種、原種及栽培種進行逐級擴繁，而菌種傳代次數越多，產生突變的幾率越高，菌種發生衰退的機會就越多。在生產中應嚴格控制菌種傳代次數，尤其是母種，一般不能超過5代。在菌種傳代保藏中，除需控制傳代次數外，應適時變換培養基質或改變配方進行提純復壯，增強其活力[63]。

2.4 其他方法

采用臭氧、紫外線燈、甲醛熏蒸可對接種室進行徹底的殺毒滅菌[64]。提高菌種生產者的素質，要熟悉無菌操作技術，對其保藏和使用品種的種性有全面的了解，有豐富的菌種鑒定、鑒別經驗，以避免在菌種生產中出現人為選擇的錯誤。還可定期分離菌種進行復壯，即選取具典型親本特征或優于親本性狀的子實體進行菌種分離，并選擇菌絲粗壯、活力強、純度高的優良菌株進行菌種生產，這些措施有利于從源頭上防止雜菌感染和菌種衰退[65]。

3 存在問題與展望

菌種質量是由自身的遺傳特性、外界的生長條件、人為因素共同決定的，只有綜合考慮以上幾個因素才能從本質上對菌種質量進行有效地控制。關于影響食用菌菌種質量的環境因素[21-30]及相應的解決措施有諸多報道[53-65]，但對食用菌內部遺傳物質(基因)如何調控菌絲體生長發育，霉菌如何侵染菌絲體，菌種老化、種性退化的形成機制等研究還不夠深入，后續的研究應該進一步去探明這些具體問題的形成機理。

在食用菌生產中，菌種質量的優劣直接影響著食用菌的產量和品質，是產生經濟效益的關鍵因素之一，在實際生長中，存在大規模多批次的用種需求，需要對菌種進行頻繁的繼代培養。因此，雜菌感染、老化及品種種性退化等突出問題往往是無法完全避免的，通過了解和掌握影響食用菌菌種質量的因素及提高菌種質量的處理方法，提前對使用品種的種性有全面而豐富的鑒定、鑒別經驗。通過加強營養、培養條件控制，結合適宜的菌種保藏手段，并提高菌種生產者的理論知識及無菌操作技術水平等方式，最大限度地減少和消除菌種培養過程中的雜菌感染及品種退化，將有利于提高食用菌的菌種制備的穩定性和均一性，對促進食用菌栽培的健康穩定發展具有重要意義。