FOXO1 對急性肺損傷小鼠肺泡上皮鈉通道的調(diào)控作用及其機制

何 婧, 王導(dǎo)新, 鄧 旺

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，重慶 400010）

急性呼吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome， ARDS） 是一種常見的危重病，中 重度ARDS 死亡率高達(dá)40%［1］。 ARDS 發(fā)生發(fā)展過程中，由于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞正常屏障功能受損，大量富含蛋白的液體滲出并聚集在肺泡腔內(nèi)，使有效肺泡面積減少，影響正常氣體交換功能，引起頑固性低氧血癥［1-3］。及時有效地清除肺泡腔內(nèi)過多的液體對維持氣體交換、提高氧合和改善預(yù)后至關(guān)重要［4］。研究［5］顯示：肺泡上皮鈉通道（epithelial sodium channel， ENaC） 是肺泡內(nèi)水腫液清除（alveolar fluid clearance，AFC） 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 本課題組前期對ENaC 的研究［6-7］ 顯 示： 肺 內(nèi) 激 活PI3K-mTORC2-AKT/SGK1 信號可以進一步磷酸化Nedd4-2， 抑制Nedd4-2 對ENaC 的泛素化降解而使ENaC 保留在細(xì)胞膜上，以增加肺泡上皮細(xì)胞ENaC 蛋白的表達(dá)豐度、促進AFC。這一過程是從蛋白降解水平發(fā)揮對ENaC 的調(diào)控作用，理論上僅對肺泡上皮細(xì)胞ENaC 蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生影響。 本課題組前期研究［6］ 顯 示：激 活PI3K 信 號 通 路 后，ENaC 轉(zhuǎn) 錄 水平明顯升高，這一現(xiàn)象并不能采用上述機制來解釋。研究［8-9］顯示：叉頭框（forkhead box， FOX）蛋白是胰島素信號通路下游的關(guān)鍵分子，PI3K 信號可使叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1 （forkhead transcription factor 1， FOXO1） 發(fā)生磷酸化后轉(zhuǎn)位出細(xì)胞核而失去轉(zhuǎn)錄活性，然而FOXO1 是否參與了胰島素信號對肺泡ENaC 的調(diào)控及其調(diào)控效應(yīng)目前尚不明確。ENaC 由α、β 和γ 3 個同源亞基組成，表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞頂膜， 其中α 亞基表達(dá)水平最為豐富，α 亞基在肺泡AFC 過程中起重要作用，因此本實驗選取αENaC 作為研究指標(biāo)。本課題組在前期研究基礎(chǔ)上擬進一步研究FOXO1 對急性損傷狀態(tài)肺泡上皮細(xì)胞αENaC 的作用，并闡明FOXO1 的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、細(xì)胞、主要試劑和儀器雄性C57BL/6J 小鼠20 只，體質(zhì)量20～25 g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心， 動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （渝） 2012-0001， 動 物 使 用 許 可 證 號：SYXK （渝） 2012-0001，于SPF 級分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。肺泡上皮A549 細(xì)胞由中國生命科學(xué) 院 細(xì) 胞 典 藏 庫 提 供， 脂 多 糖（lipopolysaccharide ， LPS） 購自美國Sigma 公司，Anti- αENaC 抗體購自中國賽默飛世爾公司，F(xiàn)OXO1 蛋 白 和 磷 酸 化 FOXO1 蛋 白（phosphorylated FOXO1，pFOXO1）、anti-FOXO1和anti-pFOXO1 （Ser256） 抗 體 購 自 美 國Cell Signaling 公司，二抗購自中國中杉金橋公司。酶標(biāo)儀和電泳儀購自美國Bio-Rad 公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2動物分組和干預(yù)方式20 只雄性小鼠隨機分為對照組和LPS 組，每組10 只。向小鼠腹腔注射2% 戊巴比妥鈉（50 mg·kg－1） 麻醉，以腰池引流管為導(dǎo)管經(jīng)口行氣管插管，并向LPS 組小鼠氣管內(nèi) 滴 入LPS （5 mg·kg－1LPS 溶 于50 μL 生 理 鹽 水中） 模擬急性肺損傷（acute lung injury， ALI） 模型，對照組小鼠僅滴入等量生理鹽水。24 h 后過量麻醉處死小鼠，取肺組織標(biāo)本進行后續(xù)實驗。

1.3 HE染色觀察對照組和LPS組小鼠肺損傷評分完整分離2 組小鼠左肺組織，以4% 多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE 染色后觀察肺組織病理學(xué)變化并行肺損傷評分，觀察炎性細(xì)胞浸潤、肺泡出血、肺水腫、肺泡間隔增寬或透明膜形成4 項指標(biāo)，根據(jù)肺損傷嚴(yán)重程度分別進行評分（0 分：無病變；1 分：輕度病變；2 分：中度病變；3 分：重度病變；4 分：極重度病變），累計總分為小鼠肺損傷評分。

1.4 FOXO1過表達(dá)重組腺病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建在基因庫（GenBank） 中檢索FOXO1 基因序列，通過RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄合成FOXO1 基因的cDNA。引入酶切位點， 設(shè)計帶酶切位點的引物， 采用PCR 技術(shù)擴增目的基因，并采用1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收。將合成好的基因片段經(jīng)酶切后載入穿梭質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化至DH5a 感受態(tài)大腸桿菌中擴增，回收測序，測序正確后導(dǎo)入慢病毒載體，構(gòu)建ADV-FOXO1。以構(gòu)建的ADV-NC 空載慢病毒載體作為對照組。對比FOXO1 序列，構(gòu)建特異性干擾的shRNA，同時設(shè)置亂序shRNA 作為轉(zhuǎn)染對照，將靶基因片段克隆至shRNA 載體質(zhì)粒，導(dǎo)入慢病毒載體。

1.5細(xì)胞分組和干預(yù)復(fù)蘇肺泡上皮A549 細(xì)胞，采用0.25% 胰酶消化傳代，以含10% 胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和0.1 g·L－1鏈霉素的HITFS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。干預(yù)前1 d，將A549 細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，至30% 融合時進行感染。第一部分實驗：①過表達(dá)實驗分組方式： 實驗分為空白對照組、ADV-NC 組和ADV-FOXO1 組；②基因沉默實驗分組方式：實驗分為空白對照組、shRNA-random組和shRNA-FOXO1 組； 細(xì)胞感染后在熒光顯微鏡下觀察各孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光表達(dá)，經(jīng)篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞行后續(xù)實驗。第二部分實驗：將A549 細(xì)胞分為空白對照組、胰島素組、胰島素+PI3K 抑制劑組和胰島素+AKT 抑制劑組，分別加入胰島素（100 nmol·L－1）、胰島素（100 nmol·L－1） +LY294002（10 μmol·L－1）和胰島素（100 nmol·L－1）+渥漫青霉素（30 nmol·L－1），空白對照組加入等量相應(yīng)溶解劑，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞行后續(xù)實驗。

1.6 RT-PCR法檢測2組小鼠肺組織和細(xì)胞中αENaC mRNA表達(dá)水平采用TRIzol 試劑提取2 組小鼠肺組織或細(xì)胞中總RNA，測定樣本260 和280 nm處吸光度（A） 值，計算A （260）/A （280）比值，并保證比值處于1.8～2.0，采用瓊脂糖凝膠電泳法分析提取RNA 的純度和完整性。 按照Prime Script RT Reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 參照Roche FastStart Universal SYBR Green Master Version 3.0 說明書進行RT-PCR 反應(yīng)（ENaC 各亞基引物由上海生工設(shè)計合成），以GAPDH mRNA 為內(nèi)參，按照說明配置反應(yīng)體系，設(shè)置RT-PCR 儀反應(yīng)參數(shù)。計算目的基因拷貝數(shù)，定量分析結(jié)果。采用相對定量方法RQ=2－ΔΔCt計算αENa C mRNA 表達(dá)水平，ΔΔCt＝（實驗樣品Ct－內(nèi)參基因Ct） － （基準(zhǔn)樣品Ct－內(nèi)參基因Ct）。

1.7 Western blotting法檢測各組小鼠肺組織和細(xì)胞中αENaC、FOXO1和pFOXO1蛋白表達(dá)水平分別按蛋白提取試劑盒說明書操作，裂解組織或細(xì)胞后提取蛋白，檢測蛋白濃度并調(diào)整至濃度一致，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離， 轉(zhuǎn)膜后于5% 脫脂奶粉（磷酸化蛋白使用5% BSA） 封閉1 h，分別加入各種抗體，4℃孵育過夜。次日洗膜后加入二抗，37℃孵育1 h。洗膜后經(jīng)ECL 顯色，Quality One 分析電泳圖片條帶，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.8免疫熒光法檢測各組A549細(xì)胞中FOXO1的胞內(nèi)定位情況對各組A549 細(xì)胞進行爬片，并以4% 多聚甲醛進行固定后以0.2%Triton 破膜。5% 山羊血清于37℃封閉30 min，孵育一抗，于濕盒內(nèi)4℃過夜。次日以PBS 溶液清洗爬片后，采用Alexa Fluor 594 標(biāo)記的二抗于37℃閉光孵育1 h。清洗后封片，避光4 ℃保存，采用倒置熒光顯微鏡觀察A549 細(xì)胞中FOXO1 的胞內(nèi)定位情況。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。 各組小鼠肺損傷評分、 肺組織中αENaC、FOXO1、pFOXO1 蛋白及αENaC mRNA表達(dá)水平均以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩均數(shù)比較采用LSD-t法，pFOXO1 與αENaC 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性采用Pearson 線性相關(guān)分析法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1對照組和LPS組小鼠肺組織損傷程度和損傷評分對照組小鼠肺組織未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔均一，肺泡腔和肺間質(zhì)無出血水腫；LPS組小鼠肺組織中有明顯的炎性細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增厚、肺泡和肺間質(zhì)斑片狀出血和肺水腫。LPS 組小鼠肺組織損傷評分（13.00±0.75） 明顯高于對照組（0.50±0.16）（P＜0.05）。見圖1（插頁三）。

2.2對照組和LPS組小鼠肺組織中αENaC、FOXO1和pFOXO1蛋白表達(dá)水平LPS 組小鼠肺組織中FOXO1 蛋白表達(dá)水平（0.86±0.02） 與對照組（0.83±0.01） 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）， 但pFOXO1 （Ser256） 蛋 白 表 達(dá) 水 平 和αENaC 蛋白表達(dá)水平（0.48±0.01 和0.31±0.02）較對照組（0.23±0.01 和0.19±0.02） 明顯降低（P＜0.05）， 且 二 者 之 間 呈 正 相 關(guān) 關(guān) 系（r=0.703，P＜0.05）。見圖2。

圖2 2 組 小 鼠 肺 組 織 中α ENaC 、FOXO1 和pFOXO1(Ser256)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of αENaC,FOXO1, and pFOXO1(Ser256) proteins in lung tissue of mice in two groups

2.3 FOXO1基因過表達(dá)后各組A549細(xì)胞中FOXO1和pFOXO1蛋白（Ser256） 及αENaC mRNA表達(dá)水平感 染ADV-FOXO1 （Thr24 、Ser256 和 Ser319 磷 酸 化 位 點 突 變） 后，ADV-FOXO1 組A549 細(xì) 胞 中FOXO1 蛋 白 表 達(dá) 水平（0.89±0.02） 較 對 照 組（0.46±0.01） 和ADV-NC 組（0.43±0.01） 明顯升高，但pFOXO蛋白表達(dá)水平（0.11±0.01） 較對照組（0.59±0.01） 和ADV-NC 組（0.63±0.01） 明 顯 降 低（P＜0.05）； ADV-NC 組和對照組A549 細(xì)胞中FOXO1 蛋白表達(dá)水平和pFOXO1 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）， ADV-FOXO1組A549 細(xì) 胞 中αENaC mRNA 表 達(dá) 水 平（0.10±0.01） 較對照組（0.19±0.00） 明 顯 降低（P＜0.05）；ADV-NC 組A549 細(xì) 胞 中αENaC mRNA 表達(dá)水平（0.18±0.00） 與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組A549 細(xì)胞中FOXO1 和pFOXO1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of FOXO1 and pFOXO1(Ser256) proteins in A549 cells in various groups

2.4 FOXO1基因沉默后各組A549細(xì)胞中FOXO1蛋白和αENaC mRNA表達(dá)水平沉默F(xiàn)OXO1 基因后，shRNA-FOXO1 組FOXO1 蛋白表達(dá)水平（0.19±0.01） 較 對 照 組 （0.87±0.01） 和shRNA-random 組（0.88±0.02） 明顯降低（P＜0.05）， shRNA-random 組 與 對 照 組A549 細(xì) 胞 中FOXO1 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。shRNA-FOXO1 組A549 細(xì)胞中αENaC mRNA 表達(dá)水平（0.21±0.01） 較對照組（0.18±0.00） 明顯升高（P＜0.05）；shRNArandom 組A549 細(xì) 胞 中αENaC mRNA 表 達(dá) 水 平（0.19±0.00） 與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組A549 細(xì)胞中FOXO1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of FOXO1 protein in A549 cells in various groups

2.5各組A549細(xì)胞中FOXO1和pFOXO1蛋白及αENaC mRNA表達(dá)水平對照組、胰島素組、胰島素+PI3K 抑制劑組和胰島素+AKT 抑制劑組A549 細(xì)胞中FOXO1 蛋白表達(dá)水平（0.43±0.01、0.44±0.01、 0.44±0.01 和0.45±0.01） 組 間 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；胰島素組A549細(xì)胞中pFOXO1 蛋白表達(dá)水平（0.90±0.01） 較對照組（0.52±0.01） 明顯升高（P＜0.05）， 胰島素+PI3K 抑制劑組和胰島素+AKT 抑制劑組A549 細(xì)胞中pFOXO1 蛋白表達(dá)水平（0.50±0.01和0.50±0.01） 與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但較胰島素組明顯降低（P＜0.05）。見圖5。胰島素組A549 細(xì)胞中αENaC mRNA 表達(dá)水平（0.21±0.01） 較對照組（0.17±0.00） 明顯升高（P＜0.05）， 胰島素+PI3K 抑制劑和胰島素+AKT 抑制劑組A549 細(xì)胞中αENaC mRNA 表達(dá)水平（0.18±0.01 和0.19±0.01） 與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但較胰島素組明顯降低（P＜0.05）。

圖5 各組A549 細(xì)胞中FOXO1 和pFOXO1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of FOXO1 and pFOXO1 proteins in A549 cells in various groups

2.6各組A549細(xì)胞中FOXO1的胞內(nèi)定位情況免疫熒光檢測結(jié)果顯示： 對照組A549 細(xì)胞中FOXO1 在肺泡上皮細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，胰島素組， FOXO1 主要表達(dá)于細(xì)胞漿， 而胰島素+PI3K 抑制劑和胰島素+AKT 抑制劑組FOXO1 主要表達(dá)在細(xì)胞核。見圖6 （插頁三）。

3 討 論

ARDS 發(fā)病機制復(fù)雜，且尚未完全闡明，至今仍缺乏特異性的治療方法。發(fā)生ARDS 時，肺泡腔內(nèi)大量水腫液聚集，嚴(yán)重影響了正常的氣體交換功能，引起了頑固性低氧血癥。及時有效地清除肺泡腔內(nèi)過多的液體可明顯降低ARDS 死亡率［10］，這是治療的關(guān)鍵點。研究［5］顯示：ENaC 是肺泡內(nèi)AFC 的限速環(huán)節(jié)，上調(diào)ENaC 表達(dá)有利于肺泡腔內(nèi)水腫液的重吸收。ENaC 由α、β 和γ3 個同源亞基組成，表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞頂膜，其中α 亞基表達(dá)水 平最為豐富。研究［11］顯 示：αENaC 基因敲除小鼠因不能清除肺泡內(nèi)液體，在出生后40 h 之內(nèi)死亡，表明α 亞基在肺泡AFC 過程中起重要作用，因此本實驗選取αENaC 作為研究指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明：在LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中，αENaC mRNA 表達(dá)水平明顯降低，pFOXO1 蛋白表達(dá)水平亦明顯降低；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：二者表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，提示急性肺損傷小鼠肺泡上皮細(xì)胞中αENaC 基因的表達(dá)調(diào)控可能與FOXO1 有關(guān)聯(lián)。

FOX 蛋白屬于核轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，廣泛存在于真核生物中，通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)糖代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期阻滯和免疫調(diào)節(jié)等多個生物學(xué)過程［12-13］，F(xiàn)OXO1 廣泛分布于各組織器官中，在肺組織中有明顯表達(dá)［14］。FOXO1 在細(xì)胞核內(nèi)可通過DNA 結(jié)合域結(jié)合靶基因啟動子中的一段高度保守的DNA 結(jié)合序列——5′-GTAAA（C/T） A-3′或胰島素反應(yīng)元件（IRE） ——5′-CAAAA （C/T） A-3′，從而對靶基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控。研究［15］顯示： ENaC 基因啟動子序列中存在 一 段 類 似IRE ［5′-CAAAA （C/T） A-3′］ 的FOXO1 結(jié)合元件，因此本文作者推測：FOXO1 可能通過與ENaC 基因啟動子結(jié)合元件結(jié)合或解聚對其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 然而在不同的組織中，F(xiàn)OXO1 對目標(biāo)靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控效應(yīng)不同。目前大多數(shù)情況下FOXO1 被認(rèn)為對靶基因的轉(zhuǎn)錄起正向調(diào)控作用， 即FOXO1 發(fā)揮促進靶基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)［16-17］。近期研究［18-19］顯示：FOXO1 亦可以發(fā)揮抑制靶基因轉(zhuǎn)錄活性的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)，例如在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，過表達(dá)FOXO1 會抑制內(nèi)皮細(xì)胞MYC 及其下游基因表達(dá)，在腦垂體細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1 抑制Lhb 基因轉(zhuǎn)錄活性，降低黃體生成素的分泌水平。但FOXO1 在肺泡上皮細(xì)胞中對靶基因αENaC 轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控方向尚不明確。因此，本課題組進一步研究FOXO1 在肺泡上皮細(xì)胞中對αENaC 的調(diào)控作用的結(jié)果表明： 過表達(dá)FOXO1 時，A549 細(xì) 胞 中αENaC mRNA 表 達(dá) 水 平被抑制， 而沉默F(xiàn)OXO1 基因時， αENaC mRNA表達(dá)水平明顯升高。本研究結(jié)果顯示：在小鼠肺泡上皮細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1 對αENaC 基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負(fù)向調(diào) 控 效 應(yīng)， 抑 制 了αENaC 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平。 與WILHELM 等［18］的 研 究 結(jié) 果 一 致。 FOXO1 在 不同組織中對其靶基因轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控方向的差異可能與靶基因的特性有關(guān)聯(lián)。

FOXO1 對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控活性很大程度上取決于其在細(xì)胞內(nèi)的定位。當(dāng)FOXO1 定位于細(xì)胞核內(nèi)， 與靶基因結(jié)合， 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用； 當(dāng)FOXO1 從細(xì)胞核內(nèi)穿梭至胞質(zhì)內(nèi)，遂與靶基因分離，轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性降低。由此可見：FOXO1 在靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起“閘門” 作用，是介導(dǎo)上游轉(zhuǎn)錄信號向下游靶基因傳遞的控制器。磷酸化是影響FOXO1 在細(xì)胞內(nèi)定位的主要因素之一。 FOXO1具有高度保守的磷酸化位點（Thr24、 Ser256 和Ser319），可被蛋白激酶磷酸化。pFOXO1 從細(xì)胞核穿梭至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與靶基因啟動子解離，對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性減弱；同時與14-3-3 蛋白結(jié)合，維持磷酸化狀態(tài)并穩(wěn)定滯留于胞質(zhì)內(nèi)而后被降解［20］。 PI3K 是一個能夠調(diào)控FOXO1 磷酸化的上游信號分子。研究［8］證實：激活PI3K／AKT 信號通路能夠使FOXO1 蛋白磷酸化，引起FOXO1穿梭出核并定位于細(xì)胞質(zhì)，失去結(jié)合靶基因的能力，轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性降低。

本研究結(jié)果表明： αENaC mRNA 表達(dá)水平與FOXO1 的磷酸化程度呈正相關(guān)關(guān)系。同時，胰島素可促進FOXO1 磷酸化， 并從基因?qū)用嬖黾应罞NaC 的表達(dá)水平，該作用可分別被PI3K 抑制劑和AKT 抑制劑阻斷，提示胰島素的效應(yīng)是通過其經(jīng)典信號通路——PI3K/AKT 信號通路產(chǎn)生的。胰島素刺激后，F(xiàn)OXO1 在小鼠肺泡上皮細(xì)胞中的定位由胞核易位至細(xì)胞漿，而分別采用PI3K 抑制劑和AKT 抑制劑后，F(xiàn)OXO1 的易位效應(yīng)明顯減弱，提示胰島素激活的PI3K-AKT 信號使FOXO1 磷酸化出胞， 失去對αENaC 的抑制效應(yīng)， 從而使αENaC mRNA 合成增加。本研究結(jié)果證實：在肺泡上皮細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1 亦是通過磷酸化途徑發(fā)揮胞核穿梭效應(yīng)，從而對αENaC 轉(zhuǎn)錄水平進行有效調(diào)控。本研究結(jié)果是對前期研究的補充，詮釋了激活PI3K/AKT 信號通路從基因水平上調(diào)αENaC 的分子機制。

綜上所述，在肺泡上皮細(xì)胞中，PI3K/AKT 信號促使FOXO1 發(fā)生磷酸化并由胞核穿梭至胞質(zhì)內(nèi)，繼而與αENaC 啟動子解離，失去對αENaC 轉(zhuǎn)錄抑制作用， 從而激活轉(zhuǎn)錄， 上調(diào)αENaC 水平，促進肺泡AFC，從而改善ARDS 的預(yù)后。FOXO1通過介導(dǎo)PI3K/AKT 信號調(diào)控αENaC mRNA 的表達(dá)。