胃癌患者血清中胃癌相關細胞因子檢測及其在胃癌診斷中的應用價值

孫瑞營, 李 洋, 趙 旭, 曲林琳, 續 薇, 張蘊莉

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧 錦州 121000；2.吉林大學第一醫院檢驗科，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院肝膽胰內科，吉林 長春 130021）

胃癌尤其是胃腺癌，是中國乃至全世界最常見的惡性腫瘤之一。調查［1］顯示：我國每年新發胃癌病例約40 萬例，死亡率總體呈上升趨勢。胃癌早期無明顯癥狀，或與胃炎和胃潰瘍等胃慢性疾病癥狀相似。因此早期診斷和治療是降低患者死亡率及改善患者預后的重要手段。目前，臨床上常用的胃癌診斷方法是基于腫瘤標志物的檢測，主要包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖鏈抗 原19-9 （carbohydrate antigen 19-9， CA19-9）和 糖 鏈 抗 原72-4 （carbohydrate antigen 72-4，CA72-4） 這3 種。 研 究［2］表 明： 腫 瘤 標 志 物CEA、 CA19-9 和CA72-4 的水平受疾病的進展和臨床分期影響較大，單獨檢測可能存在對胃癌診斷靈敏度和特異度不高的情況，故腫瘤標志物聯合檢測對提高胃癌診斷的準確度具有重要作用。研究［3］表明：多種細胞因子與胃癌的發生發展有著密切關系。微小RNA 在腫瘤中起多種關鍵作用，本課題組前期研究［4］已證實：miR-10b 作為上游因子抑制Tiam1/Rac1 介導的胃癌細胞的發生和轉移，推測miR-10b 和細胞因子表達與胃癌的發生有關聯。但目前關于細胞因子對胃癌診斷價值的研究較少，ELISA 等常用檢測方法大多以單一因子檢測為主，現有研究中所檢測的細胞因子種類較少，也不盡相同，同時未與臨床上常用的胃癌診斷方式進行比較。本研究采用Luminex 高通量液相芯片技術檢測胃癌患者血清中巨噬細胞炎性蛋白 3α（macrophage inflammatory protein-3α， MIP-3α/CCL20）、白細胞介素2 （interleukin-2，IL-2）、白細胞介素4 （interleukin-4， IL-4）、 白細胞介素5（interleukin-5， IL-5）、 白細胞介素6 （interleukin-6，IL-6）、白細胞介素10 （interleukin-10，IL-10）、白細胞介素17A （interleukin-17A， IL-17A）、 腫瘤 壞 死 因 子α （tumor necrosis factor-α， TNF-α）、干擾素γ （interferon-γ，IFN-γ）、單核細胞趨化因子（monocyte chemoattractant protein -4，CCL13）、干擾素誘導T 細胞α 趨化因子（interferon-induced T cell alpha chemokine，CXCL11）、B 淋巴細胞趨化因子（B-lymphocyte chemoattractant，CXCL13）、骨 形 成 蛋 白4 （bone morphogenetic protein 4，BMP4）、骨形成蛋白7 （bone morphogenetic protein 7， BMP7）、 肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、粒細胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor， GM-CSF）、血小板衍生因子BB （platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB） 的表達水平，從miR-10b 與細胞因子的相關性以及細胞因子與胃癌的關系兩個方面探討相關細胞因子在胃癌診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1研究對象基于病例對照研究設計， 以2016 年12 月—2017 年12 月在吉林大學第一醫院確診為胃腺癌的患者血清標本34 例作為胃癌組，以同期來自體檢中心的健康者血清標本80 例作為對照組，所有患者均知情同意，本研究獲錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。收集所有研究對象的臨床信息，包括年齡、性別、實驗室常規檢查和術后病理組織學檢測等信息。樣本采集要求：清晨空腹肘靜脈真空負壓采血， 采血量為3.5 mL，血 液 采 集 后2 h 內 進 行3 700 r·min－1室 溫 離心5 min，取上層血清置于－80℃低溫冰箱中儲存待進一步分析。胃癌組納入標準：①明確診斷為胃腺癌的患者；②術前未進行放療、化療和生物免疫治療，術前無其他腫瘤病史者；③胃癌病理TNM分期明確者。排除標準：①資料不完整者；②并發其他腫瘤或臟器疾病者；③近期有輸血史者。對照組納入標準：①標本來源為吉林大學第一醫院體檢中心的健康者；②血、尿、便、生化和腫瘤標志物等實驗室檢測結果正常者；③超聲和CT等影像結果正常者。

1.2主要試劑和儀器17 種細胞因子檢測試劑盒購于美國R&D 公司，miR-10b 檢測試劑盒購于北京全式金生物公司， CEA、 CA19-9 和CA72-4 檢測試劑盒購于美國Roche 公司。 液相芯片分析儀（型號X-200 Luminex， 美國R&D 公司）， 實時熒光 定 量PCR （quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR） 儀（型號C obas z480，美國Roche 公司），電化學發光全自動免疫分析系統（型號Cobas e601，瑞士羅氏公司）。

1.3檢測方法對17 種細胞因子的檢測采用Luminex 方法，檢測結果表示為ng·L－1；實驗采用同樣方法測得不同濃度的蛋白標準品作為質量控制，同時樣本采用雙孔數據重復，以保證檢驗結果的準確性。①準備好所需試劑及樣品， 在96 孔板中每孔加入200 μL 清洗液，室溫震蕩10 min 后倒掉，加入25 μL 標準品、質控品于對應孔，25 μL緩沖液于背景孔和樣品孔，25 μL 血清于背景孔、標準品孔和質控品孔，加入25 μL 預混磁珠微球于每孔，封口，室溫震蕩2 h；②將微孔板放置于磁力架上至少1 min，確保微球被吸附住，采用清洗液每孔200 μL 洗滌2 次；③每孔加 入25 μL 生物素標記的檢測抗體復合物，同樣室溫下1 h，搖床速度設置為800 r·min－1，微孔板封口；④不清洗，每孔加入25 μL 鏈霉親和素標記的PE，同樣室溫下0.5 h，搖床速度設置為800 r·min－1，微孔板封口；⑤將微孔板放置于磁力架上至少1 min，確保微球被吸附住，采用清洗液每孔200 μL 清洗2 次；⑥采用150 μL 清洗液重懸微球，孵育5 min，搖床速度設置為800 r·min－1，上機檢測。

miR-10b mRNA 水平檢測采用qRT-PCR 方法，測定結果以CT 值表示；①血清miRNA 的提取，首先在冰盒上緩慢溶解取出的凍存血清，吸取200 μL 血 清 至1 只 新 的1.5 mL RNAse-free 離 心 管中，隨即加入5 mol·μ L－1cel-miR-39-3p 標 準 品5 μL，每個血清樣品加入標準品后立即渦旋，隨后采 用EasyPure? miRNA 試 劑 盒 提 取miR-10b ；②miRNA 加尾反應及合成為cDNA，配置反應體系，包 含9.2 μL miRNA 模 板；1 μL TransScript?miRNA RT Enzyme Mix； 10 μL 2×TS miRNA Reaction Mix，總體積為20 μL。在以上反應體系瞬時離心后，在37℃下反應60 min、85℃條件下反應5 s； ③qRT-PCR 反 應， 將 得 到 的cDNA 采 用RNAse-free Water 稀釋5倍。配置qRT-PCR 體系，包 括6 μL5 倍 稀 釋 的cDNA 、 2 μ L 上 游 引 物（2 μmol·L－1）； 2 μL 通 用 引 物（2 μmol·L－1） 和10 μL 2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix，總體積為20 μL。將配置好的八連管放入qRT-PCR儀中， 在94℃下反應30 s 后， 在94 ℃、 30 s 及60 ℃、5 s 的溫度體系下完成40 個循環。反應結束后檢測反應特異度。3 種腫瘤標志物的檢測采用電化學發光法，準備好所需試劑及樣品放入標本位進行檢測， CA199 和CA724 測定結果單位為U·mL－1，CEA 測定結果單位為μg·L－1。

1.4統計學分析采用SAS 9.4 統計軟件進行統計學分析。胃癌組患者血清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-17A、GM-CSF、BMP-4 和PDGF-BB 水平符合正態分布，以x±s表示；胃癌組患者血清中其他因子以及對照組研究對象血清中17 種細胞因子水平不滿足正態分布，以M （P25，P75） 表示，進行非參數統計Wilcoxon 秩和檢驗。2 組研究對象性別構成比比較采用χ2檢驗。采用Spearman 等級相關系數評估胃癌組患者血清中細胞因子與miR-10b 水平的相關性。采用單因素Logistic 回歸模型分析胃癌組患者胃癌患病風險與細胞因子之間的關聯性并計算曲線下面積（area under curve， AUC），評估細胞因子預測腫瘤的價值。 采用約登系數（Youden index，YI） 確定細胞因子最優臨床截斷值。計算細胞因子和臨床常用腫瘤標志物對胃癌診斷的準確度，評估細胞因子在胃癌診斷中的應用價值：靈敏度=真陽性人數/（真陽性人數+假陰性人數） ×100%；特異度=真陰性人數/（真陰性人數+假陽性人數） ×100%；陽性似然比=靈敏度/（1―特異度）；陰性似然比= （1―靈敏度） /特異度； 陽性預測值= （靈敏度× 患病率） / ［靈敏度×患病率+ （1―患病率）（1―特異度）］；陰性預測值=特異度× （1― 患病率） / ［特異度×（1―患病率） + （1―靈敏度） ×患病率］。

2 結 果

2.1對照組和胃癌組研究對象血清中17種細胞因子水平對照組和胃癌組研究對象的平均年齡分別為（58.00±10.66） 歲和（61.00±9.11） 歲， 對照組和胃癌組研究對象中女性所占的比例分別為46.25% 和32.35%，2 組研究對象年齡和性別構成比比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比 較， 胃 癌 組 患 者 血 清 中IL-2 、 IL-4 、 IL-6 、IL-17A、 TNF- α、 CCL13、 CCL20、 BMP-4 和HGF 水平明顯升高（P＜0.05）， 而IL-5、 IL-10、IFN- γ、 GM-CSF、 CXCL11、 CXCL13、 BMP-7和PDGF-BB 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組和胃癌組研究對象血清中17 種細胞因子（IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10、 IL-17A、TNF- α、 IFN- γ、 CCL13、 CXCL11、 CXCL13、CCL20、 BMP4、 BMP7、 HGF、 GM-CSF、PDGF-BB） 水平見表1。

表1 對照組和胃癌組研究對象血清中17 種細胞因子水平Tab.1 Levels of 17 kinds of cytokines in serum of subjects in control group and gastric cancer group

2.2血清細胞因子與胃癌患病風險關系的Logistic回歸分析Logistic回歸分析結果顯示：血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α、CXCL11、CCL13、CCL20、BMP4、BMP7 和HGF 水平升高均與胃癌患病風險有關聯；與對照組比較，CCL20 水平較高的胃癌組患者患胃癌風險增加了65% （OR：1.65； 95%CI： 1.28～2.12；P＜0.01）。未發現其他細胞因子與胃癌患病風險間有關聯性。

表2 血清細胞因子水平與胃癌患病風險的關系Tab.2 Correlations between serum levels of cytokines and risk of gastric cancer

2.3血清細胞因子的ROC曲線ROC 曲線分析結果顯示：細胞因子CCL20的AUC高達0.92（圖1），明顯高于腫瘤標志物CEA （AUC=0.613）、CA19-9 （AUC=0.576） 、 CA72-4 （AUC=0.482） 單獨及聯合診斷（AUC=0.64）（圖2），提示該蛋白可能是極為有效的胃癌診斷的標志物。多因子聯合診斷分析結果顯示： 與單獨使用CCL20 進行診斷比較，TNF-α、BMP-4 和CCL20這3 個細胞因子的聯合診斷對胃癌的預測能力并未明顯提高（AUC=0.93），見圖3。

采用YI 方法選取靈敏度和特異度總和最高時所對應的血清CCL20 水平為最優臨床截斷值，分析結果顯示： 當CCL20 水 平 為6.71 μg·L-1時，YI 值最大。當以該濃度作為篩查標準時，其診斷實驗的特異度為76.5%、靈敏度為91.3%、陽性預測值為78.8%、陰性預測值90.1%、陽性似然比為8.74、 陰性似然比為0.26、 診斷準確度為86.84%。 與臨床常用的腫瘤標志物CEA 、CA19-9、CA72-4 單獨或聯合診斷的效能比較，采用CCL20 進行診斷的靈敏度明顯升高，而特異度也保持在較高水平。見表3。

2.4胃癌組患者血清細胞因子與miR-10b水平的相關性胃癌組患者血清中17 種細胞因子與miR-10b 水平的相關關系較弱，其中TNF-α 與miR-10b水 平 的 相 關 系 數（r）=0.335 （P=0.075）。見表4。

3 討 論

本研究通過對胃癌組胃癌患者血清樣本和對照組健康人血清樣本中17 種細胞因子進行檢測分析發現：與對照組比較，胃癌組患者血清中CCL20、IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-17A、 TNF- α、 CCL13、BMP-4 和HGF 水平明顯升高，其中CCL20 水平較高的胃癌組患者患胃癌風險增加了65%。

圖1 與胃癌發生有關聯的細胞因子的ROC 曲線Fig.1 ROC curves of cytokines correlated with occurrence of gastric cancer

圖2 腫瘤標志物單獨和聯合診斷胃癌的ROC 曲線Fig.2 ROC curves of single and combination diagnosis of tumor markers in gastric cancer

圖3 多因子單獨和聯合診斷胃癌的ROC 曲線Fig.3 ROC curves of single and combination diagnosis of cytokines in gastric cancer

表3 CCL20 和常見腫瘤標志物對胃癌的診斷價值Tab.3 Diagnostic values of CCL20 and common tumor markers in gastric cancer

表4 胃癌組患者血清細胞因子與miR-10b 水平的相關性Tab.4 Correlations between levels of cytokines and miR-10b in patients in gastric cancer group

趨化因子是吸引淋巴細胞浸潤，產生并維持慢性炎癥的重要細胞因子，與趨化因子受體結合后可以使細胞發生趨化運動，廣泛參與細胞生長及凋亡等多種功能，從而與疾病的發生發展密切相關。多項研究［5-7］表明：胃癌組患者血清細胞因子CCL20和CCL13 水平明顯高于對照組，與本研究結論相符，提示CCL20 和CCL13 水平與胃癌患病風險有關聯。IL-2 是重要的抗腫瘤功能標志物，以往的研究［8］顯示胃癌患者血清IL-2 水平在病情嚴重時降低趨勢，與本研究結論有所不同，可能原因一是由于血清中IL-2 水平或許無法真實反映組織中IL-2水平，二是由于本研究中有56% 的患者是Ⅰ/Ⅱ期胃癌，而早期胃癌患者中IL-2 水平升高是否與腫瘤初期機體應激反應有關聯尚不清楚，因此關于IL-2 與胃癌患病風險的關聯仍需進一步研究。IL-4是Th2 產生的抗炎性細胞因子，盡管IL-4 有抑制腫瘤的功效，但有研究［9］顯示：IL-4 水平過度升高會通過下調Th1 型因子使Th 細胞平衡向Th2 方向漂移，而體內Th1 和Th2 的失衡會消減細胞介導的免疫反應，從而促進腫瘤的發生發展，這一機制可能是胃癌組患者血清IL-4 水平明顯高于對照組的原因。多項研究［10-11］顯示：胃癌患者血清IL-17過度表達，與本研究結論相符，這可能與IL-17 可通過促進血管的生成和腫瘤細胞的遷徙、從而促進胃部腫瘤的生長有關聯。 關于TNF-α、 BMP4 和HGF 與胃癌患病風險關聯的研究［12］結論多與本文研 究 結 果 一 致， TNF- α 可 能 通 過 活 化TNF- α/TNFR1 信號通路，從而誘導Noxo1 和Gnal4 參與細胞分化和腫瘤生長， 促進腫瘤的發展。 有研究［13］ 顯示： 在對淋巴結轉移患者進行治療后，TNF-α 水平有明顯降低。BMP4 和HGF 在胃癌組織 中 高 表 達［14-15］，馬 松 林 等［16］發 現：BMP4 可 能通過上調Snail 的表達促進胃癌細胞的遷移和侵襲。HGF 可通過PI3K/AKT 信號通路促進胃癌細胞的侵襲［17］。

本研究結果表明：與臨床常用的腫瘤標志物CEA、 CA19-9 和CA72-4 聯合診斷結果（AUC=0.64） 比較，采用CCL20 對胃癌患者進行診斷的AUC 較 高（AUC=0.92）， 診 斷 準 確 度 可 達86.84%。當以6.71 μg·L－1作為臨床截斷值時，診斷的靈敏度為76.47%、特異度為91.25%、陽性預測值為78.79%、陰性預測值為90.12%、陽性似然比為8.74、陰性似然比為0.26、診斷準確度為86.84%，高于3種腫瘤標志物聯合診斷的準確度（78.95%，） 提示細胞因子CCL20 可用作胃癌診斷的特異標志蛋白，有望成為新的胃部腫瘤標志物。研 究［18-19］證 實：CCL20 在 胃 癌 組 織 中 的 表 達水平明顯升高。針對胃癌的發生機制，有研究［18］顯 示： CTKL 介 導 的CCL20/CCR6 經 由Akt 途 徑誘導胃癌上皮細胞發生間質變， 且通過抑制CCL20/CCR6-CRKL-Erk1/2-EMT 途 徑， 有 望 靶向拮抗胃癌的發展。探討幽門螺桿菌與CCL20 表達關系的研究［20］顯示：胃癌和癌旁組織中CCL20水平較高，探討其相關性認為二者可能共同參與胃癌的發生發展。胃癌的發生發展是復雜的多因素過程，CCL20 在胃癌發生發展過程中的作用機制還需進一步探索，以往關于CCL20 與胃癌關系的研究多數集中在組織水平，其作為血清標志物的可能性尚未見報道。血清檢測比組織樣品測定更簡單經濟，但由于本研究中研究對象僅包含胃癌患者和健康對照者，未包含患有胃部炎癥的個體，且樣本量較小，關于其是否能作為胃癌診斷標志物應用于臨床仍需在較大范圍及較大樣本中進一步研究，后續將納入胃部炎癥樣本，多層次多角度針對CCL20水平升高的機制進行探討，為新的腫瘤標志物應用于臨床提供依據。

本研究結果顯示：TNF-α 與miR-10b 的相關性最強， 但結果并不顯著。 研究［21］顯示： 組織中miR-10b 水平與多種腫瘤的惡變和轉移有關，例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、食道癌和神經膠質瘤等。早 期 研 究［4］證 實：Tiam1/Rac1 信 號 通 路 異 常 活 化促進胃癌細胞的極性改變、炎性浸潤、侵襲和轉移， 在組織中， miR-10b 作為上游因子通過抑制Tiam1 下調Tiam1/Rac1 信號通路的活化，從而抑制Tiam1/Rac1 介導的腫瘤細胞的發生和轉移［22］。在血清中，miR-10b 水平與腫瘤大小、淋巴結轉移情況相關，隨著腫瘤直徑增大以及淋巴結的轉移，血清中的miR-10b 水平升高［23］。由此推測在影響胃癌發生發展的過程中，血清中miR-10b 水平可能與細胞因子存在相關性，從而出現炎性反應。有關胃癌相關細胞因子與miR-10b 關系的研究目前國內外未見報道。本研究也未發現胃癌組患者血清中細胞因子與miR-10b 水平間存在明顯關聯，這可能與本次研究樣本量較少，同時采用Spearman 秩相關分析使得統計效能有所降低有關。因此，關于細胞因子與miR-10b 的關聯仍需在較大樣本中進一步研究。

本研究結果顯示：胃癌組患者血清CCL20 水平明顯高于對照組。 ROC 曲線分析顯示： 當將6.71 μg·L－1作為血清CCL20 水平的臨界點時，其對胃癌診斷的靈敏度明顯優于常用腫瘤標志物CEA、CA19-9 和CA72-4，且特異度也保持在良好水平，提示血清CCL20 水平可能在胃癌診斷中具有重要的應用價值，有望成為新的胃癌標志物。