自花和異花授粉對藍(lán)莓花粉管動力學(xué)的影響*

楊 芩，羅 莉，羅 婭，劉雅蘭，張婷渟，彭 舒

（1凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州556000）（2凱里學(xué)院藍(lán)莓研究所）

自交不親和性為高等植物為了實(shí)現(xiàn)遺傳重組和保持遺傳變異的一種重要機(jī)制[1]，基于遺傳決定方式可分為孢子體自交不親和性（SSI）與配子體自交不親和性（GSI）[2]。SSI的表型由孢子體的S基因型決定，主要表現(xiàn)為花粉在柱頭乳突細(xì)胞表面不能正常萌發(fā)，或萌發(fā)后在柱頭乳突細(xì)胞上彎曲生長而不能進(jìn)入花柱組織；GSI的表型則是由花粉自身的單倍體基因所決定，主要表現(xiàn)為花粉管通常在花柱組織，或花粉管與胚囊組織間停止生長[3-4]。前人研究表明，梨[5-6]、蘋果[6-7]、李[8]和枇杷[9]等薔薇科果樹均屬于 GSI類型。藍(lán)莓屬杜鵑花科越橘屬（Vacciniumspp.）多年生落葉或常綠灌木果樹[10]，藍(lán)莓大多為自花授粉結(jié)實(shí)率極低或不結(jié)實(shí)，多數(shù)品種具自交不親和性[11-12]。因此，在生產(chǎn)栽培中需多品種搭配建園，以保證坐果和提高產(chǎn)量[13-15]。然而，迄今為止，關(guān)于藍(lán)莓自交不親和性的花粉管動力學(xué)研究鮮有報道。

本研究以‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’2個品種為試材，開展自花和異花授粉，采用熒光顯微觀察方法研究自花和異花授粉后不同時間花粉萌發(fā)、花粉管生長至花柱上部、中部和基部的花柱比率，分析自花和異花授粉對參試品種花粉管動力學(xué)的影響，以期為深入認(rèn)識藍(lán)莓授粉受精生物學(xué)特性及自交不親和生物學(xué)機(jī)制積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植于凱里學(xué)院卓越農(nóng)林人才培養(yǎng)實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)5年生的兔眼藍(lán)莓‘園藍(lán)’和北高叢藍(lán)莓‘藍(lán)金’為試材，每個品種隨機(jī)選取20株生長健壯、無病蟲害、長勢一致的作為參試植株，異花授粉花粉采自同園內(nèi)5年生的兔眼藍(lán)莓品種‘燦爛’。

1.2 試驗方法

1.2.1花粉收集與授粉

2018年3月16—29日盛花期，在參試植株樹冠外圍中上部選取長勢一致的中果枝[10]，大蕾期花去雄后，其余花疏掉，然后用尼龍網(wǎng)袋套袋隔離，每個授粉處理組合共去雄540朵。去雄后第3 d，將2.0 mL的離心管放置于‘園藍(lán)’或‘藍(lán)金’花冠的正下方，用鑷子輕輕碰撞花冠收集花粉[13]，然后鑷子頭蘸滿花粉，輕觸柱頭幾次，進(jìn)行自花授粉，至柱頭表面明顯觀察到花粉為止；采用相同的方法用‘燦爛’的花粉進(jìn)行異花授粉。授粉后立即用尼龍網(wǎng)袋套袋隔離。

1.2.2材料收集與固定

參照枇杷花粉管動力學(xué)研究方法[16]，授粉后第2、4、8、12、24、48、72、96、120 h取樣，然后立即用FAA（38%甲醛∶冰醋酸∶70%酒精=5∶5∶90）固定處理，每個授粉組合采集60朵花，每20朵花為1次重復(fù)，共3次重復(fù)。

1.2.3軟化處理與熒光顯微觀察

按照楊芩等[17]的方法，用解剖刀和解剖針將各授粉組合經(jīng)FAA固定預(yù)處理的花柱和子房分離，分別裝入10 mL的小玻璃瓶中，然后用1 mol/L NaOH溶液在常溫下軟化處理，處理期間每天觀察1次，花柱和胚珠透明后立即用蒸餾水清洗2～3次，然后加入0.1%苯胺藍(lán)染色液染色48 h；染色后的花柱和胚珠壓片，置于OLYMPUS-BX53型熒光顯微鏡下觀察，用DP70攝像頭拍照，統(tǒng)計分析自花和異花授粉后被花粉管生長穿過上部、中部和基部的花柱比率，以及胚囊活力情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理與統(tǒng)計后，將所有百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件中的SNK檢驗在5%水平下進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 自花授粉和異花授粉對花粉管生長穿過花柱上部的影響

從圖1可以看出，在授粉后2 h或4 h，參試品種無論是異花授粉還是自花授粉，花粉管均未能生長至花柱上部。各授粉組合至授粉后8 h均可在花柱上部觀察到花粉管，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’均表現(xiàn)出異花授粉后被花粉管生長穿過上部的花柱比率顯著高于自花授粉。隨授粉時間的延長，各授粉組合被花粉管生長穿過花柱上部的花柱比率均逐漸增加，至授粉后48 h，被花粉管生長穿過上部的花柱比率均高于75%，同一品種內(nèi)異花授粉中被花粉管生長穿過上部的花柱比率顯著高于自花授粉。在授粉后72～120 h，被花粉管生長穿過上部的花柱比率同品種自花和異花授粉組合間差異不顯著。在授粉后120 h，各授粉組合被花粉管生長至花柱上部的花柱比率均達(dá)到98%。

2.2 自花授粉和異花授粉對花粉管生長穿過花柱中部的影響

圖1 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h花粉管生長至花柱上部的比率比較

從圖2可以看出，授粉后12 h內(nèi)，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’自花授粉和異花授粉處理未發(fā)現(xiàn)有花粉管能生長至花柱中部。授粉后24 h，‘園藍(lán)’自花授粉花粉管生長至中部的花柱比率僅為12%，顯著低于異花授粉的48%；‘藍(lán)金’自花授粉花粉管生長至中部的花柱比率為22%，顯著低于異花授粉的43%，‘藍(lán)金’自花授粉處理的花粉管生長至中部的花柱比率顯著高于‘園藍(lán)’的自花授粉。在授粉后72 h，各授粉組合花粉管生長至中部的花柱比率均在65%以上，異花授粉后花粉管生長至花柱中部的花柱比率仍顯著高于自花授粉。授粉后96 h，各授粉處理組合花粉管生長至花柱中部的花柱比率均達(dá)到90%，且至授粉后120 h，各授粉處理組合差異均不顯著。

圖2 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h花粉管生長至花柱中部的比率比較

2.3 自花授粉和異花授粉對花粉管生長穿過花柱基部的影響

從圖3可以看出，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’自花授粉和異花授粉后24 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有花粉管生長至花柱基部。授粉后48 h，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’異花授粉處理觀察到少量花柱基部有花粉管，自花授粉處理的花柱基部均未觀察到花粉管。授粉后72 h，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’異花授粉處理的花柱基部觀察到花粉管的比率均高于60%，自花授粉處理僅有25%左右的花柱基部被花粉管生長穿過。值得注意的是，至授粉后120 h，‘藍(lán)金’自花和異花授粉處理的花柱基部被花粉管生長穿過的比率無顯著性差異，均超過95%；‘園藍(lán)’異花授粉處理花粉管生長至基部的花柱比率顯著高于自花授粉，自花授粉處理的比率僅為32%，花柱基部為‘園藍(lán)’自花授粉花粉管停止生長的關(guān)鍵部位。

圖3 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h花粉管生長至花柱基部的比率比較

2.4 自花授粉和異花授粉后對花粉管生長至胚珠的影響

從圖4可以看出，在授粉后72 h，各授粉組合處理均能在胚珠中觀察到花粉管，自花授粉處理‘園藍(lán)’比率為3.33%、‘藍(lán)金’為8.67%，異花授粉處理‘園藍(lán)’為15.33%、‘藍(lán)金’為13.33%，同一品種異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率顯著高于自花授粉。在授粉后96 h，‘園藍(lán)’異花授粉處理30.67%的胚珠中可以觀察到花粉管，顯著高于自花授粉的9.33%；‘藍(lán)金’異花授粉處理29.33%的胚珠中可以觀察到花粉管，顯著高于自花授粉的26.00%。授粉后120 h，‘藍(lán)金’異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率為43.33%，顯著高于自花授粉的34.00%；‘園藍(lán)’異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率為36.67%，顯著高于自花授粉的18.67%。但值得注意的是，‘園藍(lán)’自花授粉處理胚珠中有花粉管的比率僅為18.67%，顯著低于‘藍(lán)金’自花授粉的34.00%。

圖4 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h胚珠中出現(xiàn)花粉管的比率比較

2.5 自花授粉和異花授粉后對胚珠有胼胝質(zhì)的影響

從圖5可以看出，在授粉后2 h，‘園藍(lán)’與‘藍(lán)金’的自花和異花授粉均有胼胝質(zhì)出現(xiàn)，胚珠中有胼胝質(zhì)的比率為16%～30%，‘園藍(lán)’胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率顯著高于‘藍(lán)金’。隨著時間的延長，各處理胚珠出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率逐漸增加。在授粉后48 h，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率分別為47.33%和34.67%；授粉后48～120 h，‘園藍(lán)’自花授粉處理的胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率均顯著高于異花授粉處理，‘藍(lán)金’自花和異花授粉處理胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率均差異不顯著。

圖5 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后2～120 h胚珠中出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率比較

2.6 自花授粉與異花授粉受精進(jìn)程

熒光顯微觀察圖片（圖6）顯示，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花和異花授粉花粉管在花柱中均有胼胝質(zhì)出現(xiàn)，但自花授粉處理的胼胝質(zhì)明顯多于異花授粉，且自花授粉處理的胼胝質(zhì)主要出現(xiàn)在花柱上部，隨花粉管的生長，在花柱中部和基部花粉管上附著的胼胝質(zhì)明顯減少。值得關(guān)注的是，‘園藍(lán)’自花授粉的花粉管在花柱基部停止生長，且花柱基部組織中出現(xiàn)大量的胼胝質(zhì)，而‘園藍(lán)’異花和‘藍(lán)金’自花與異花授粉處理的花粉管均能順利穿過整個花柱，同時2個品種異花授粉處理的花柱基部未發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)。結(jié)果表明，‘園藍(lán)’自花授粉后表現(xiàn)出典型的配子體自交不親和中的合子前不親和類型，而‘藍(lán)金’自花授粉后未表現(xiàn)出自交不親和性。

圖6 ‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉與異花授粉后120 h花粉管生長的熒光顯微圖

3 討論與結(jié)論

長期以來，國內(nèi)外學(xué)者和藍(lán)莓種植者熟知，高叢藍(lán)莓、兔眼藍(lán)莓和矮叢藍(lán)莓等栽培類型的品種大多具有自交不親和性，自花授粉不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率較低[11,13,18-20]，多品種搭配建園是保證和提高其產(chǎn)量的必要條件[21]，但關(guān)于藍(lán)莓自花和異花授粉對花粉管動力學(xué)影響的研究至今鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉后花粉管均能夠順利地穿過柱頭乳突細(xì)胞進(jìn)入花柱，且與歐洲李[22]、棗[23]、杏李[24]、草原櫻桃[25]等果樹授粉不親和現(xiàn)象類似，花粉管在花柱中生長伴隨大量的胼胝質(zhì)出現(xiàn)。然而，胼胝質(zhì)出現(xiàn)的部位卻有明顯差異，本研究發(fā)現(xiàn)，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’自花授粉后，胼胝質(zhì)主要附著在處于花柱上部的花粉管上，‘園藍(lán)’花柱基部亦出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)，而棗[23]自花授粉則在花柱基部和子房出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)，杏李[24]自花授粉后則在花柱柱頭、花柱中上部和子房室胚珠附近處有胼胝質(zhì)出現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與歐洲李[22]、棗[23]、杏李[24]、草原櫻桃[25]等果樹授粉不親和花粉管生長的規(guī)律不同，‘園藍(lán)’自花授粉后花粉管生長至花柱上部時雖附著大量胼胝質(zhì)，但仍能繼續(xù)生長至花柱中下部，且除了頂端變細(xì)外未出現(xiàn)彎曲和頂端膨大現(xiàn)象，而歐洲李[22]則在花柱中上部出現(xiàn)花粉管彎曲和膨大現(xiàn)象，杏李[24]花粉管進(jìn)入柱頭后出現(xiàn)團(tuán)狀纏繞，并伴有頂端變細(xì)和在花柱中生長出現(xiàn)回折的現(xiàn)象，梨[26]花粉管在花柱內(nèi)表現(xiàn)為扭曲變形、雜亂無章和末端變粗膨大等現(xiàn)象，然而最后的結(jié)果是都導(dǎo)致了自花的花粉管停止生長。‘園藍(lán)’這種自花花粉管在花柱中停止生長的現(xiàn)象是否像薔薇科果樹一樣歸因于自花花粉管中的RNA被花柱S-RNase所降解，或歸因于蛋白激酶和磷酸酯酶之間的相互作用，引起自花花粉發(fā)生程序化死亡，導(dǎo)致花粉管在花柱中停止生長[27]至今不得而知。因此，藍(lán)莓花粉管在花柱中停止生長的原因急需闡明，為進(jìn)一步認(rèn)識藍(lán)莓自交不親和機(jī)制的重要研究方向。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，‘園藍(lán)’和‘藍(lán)金’用‘燦爛’異花授粉的花粉管分別在授粉后48 h和72 h可以生長至花柱的基部和胚珠，生長至花柱基部和胚珠所需時間均長于李菊馨等[28]在‘密斯蒂’藍(lán)莓授粉親和性研究中發(fā)現(xiàn)的24 h和48 h。這可能歸因于不同品種，或不同發(fā)育時期自交不親和基因表達(dá)的時空差異[16,29]。此外，本研究表明，參試品種異花授粉的花粉管生長速度快于自花授粉，這與‘密斯蒂’[28]自花和異花授粉花粉管生長速度一致的結(jié)果有差異，但與自花和異花授粉對‘寒富’蘋果[30]和‘華碩’油茶[31]花粉管動力學(xué)的影響結(jié)果一致。這可能歸因于本研究授粉試驗在大蕾期去雄，去雄后第3 d授粉時為自交不親和基因在花柱內(nèi)表達(dá)最強(qiáng)的時期，從而抑制了自花花粉管的生長[16,32]。此外，在授粉后72 h，‘園藍(lán)’自花授粉的胚珠出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率顯著高于異花授粉，而‘藍(lán)金’自花授粉的胚珠出現(xiàn)胼胝質(zhì)的比率與異花授粉差異不顯著，這表明自花授粉處理可能加速了胚珠的退化[16]，但具體原因仍有待進(jìn)一步深入研究。