3個柑橘品種幼苗對低溫脅迫的生理響應及其抗寒性評價*

陽 妮，蔣景龍，李 麗，侯茹平，丁德寬，鄧家銳

（1陜西理工大學生物科學與工程學院，漢中723001）（2陜西理工大學化學與環境科學學院）（3城固縣果業技術指導站）

柑橘屬蕓香科（Rutaceae）多年生植物，喜暖畏寒，分布于北緯16～37°，是世界第一大類水果[1]。根據《中國農業統計資料》顯示，自2007年以來，我國柑橘面積和產量均居世界首位，至2017年種植面積已達到17.8萬hm2，產量3 853.32萬t[2]。陜西省南部是我國柑橘最北緣的種植區，具有獨特的生態和氣候條件，柑橘種植歷史悠久，目前柑橘產業已成為陜南地區的主導產業之一，也是農民脫貧致富的重要途徑[3]。

凍害是影響我國柑橘生產的主要因素之一，陜南地區因處于柑橘栽培的北部邊緣，冬季易發生凍害[4]。據調查，陜南地區曾出現過6次（1955、1967、1975、1991、2012、2016年）嚴重的柑橘凍害，2016年出現-11～-7 ℃的極端天氣，低溫持續時間超過20 d，造成了嚴重的經濟損失[5]。因此，如何提高柑橘的抗寒性，篩選出抗寒品種在柑橘生產中顯得至關重要。馬文濤等[6]以貴州3個野生柑橘品種和1個栽培品種的枝條為試材，在4、0、-5、-10、-15、-20、-25 ℃下各處理24 h，檢測了丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性等指標，并利用隸屬函數法分析得到抗寒性由強到弱依次為‘宜昌橙’>‘酸橙’＞‘白黎檬’＞‘默科特’。蔣景龍等[7]以漢中地區3個柑橘主栽品種為試材進行低溫處理，并通過隸屬函數法和主成分分析最終得出‘日南1號’抗寒能力最強，在各項指標中相對電導率和丙二醛含量具有較強的代表性。侯茹平等[8]選擇3個柑橘砧木品種在-7 ℃下處理36 h，分析了低溫脅迫下柑橘的形態、植株和葉片的鮮重和干重等指標，并運用隸屬函數法進行了綜合性分析，結果表明‘枳殼’抗凍能力最強，可在陜南地區推廣。因此，生理指標測定和隸屬函數法已成為評價柑橘抗寒性的重要途徑和有效方法。

‘砂糖橘’在陜南地區引進栽培，不僅能豐富當地柑橘品種，還能促進經濟和農業的發展。‘砂糖橘’主要分布于廣東、廣西等地，具有穩產、豐產的特點，因其味甜汁多深受人們歡迎，但其在陜南地區的抗寒性尚不清楚。‘冰糖橘’和‘朱紅橘’是城固縣地方特色品種，經長期篩選和栽培發展而來，與溫州蜜柑類相比抗寒性較強，適應性廣，較晚熟。因此，本研究以城固地方特色品種‘冰糖橘’和‘朱紅橘’以及引進品種‘砂糖橘’的幼苗為試驗材料，研究在-2 ℃處理1～6 d后的植株形態、細胞膜損傷、光合特性指標、滲透調節物質和抗氧化系統的變化，并利用隸屬函數法和主成分分析對各項指標進行分析，旨在綜合比較3個柑橘品種的抗寒能力，并篩選評價抗寒性的最有效生理指標，為進一步研究不同柑橘品種對低溫脅迫的響應機理奠定基礎，同時也期望為陜南地區柑橘良種的選育、引種及栽培提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的培養與處理

供試材料‘冰糖橘’‘朱紅橘’和‘砂糖橘’的果實采自漢中市城固縣果業技術指導站的陜南柑橘綜合試驗站。首先，剝取并統計果實內的種子，然后配制濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液，浸泡種子15 min，再用清水清洗30 min，置于稀釋了3倍的5%次氯酸鈉消毒液中20 min，瀝出后將種子皮用鑷子剝除，放于加滿蒸餾水的玻璃培養皿（底部平鋪濾紙）中，將培養皿放于24～28 ℃的培養箱中催芽。最后將發芽的種子移至富含營養土的32孔穴盤中，待種子出土發芽長至2片小葉時，移至苗盆中繼續生長至10～12片真葉，選取大小一致、長勢相同的幼苗置于改裝的低溫冰柜中進行低溫處理，溫度設置為-2 ℃，光照強度為4 000 lx，光照周期為16 h/8 h（白天/夜間），低溫冰箱以每小時降低2 ℃的速度降至-2 ℃。分別在低溫處理后1、2、3、4、5、6 d時進行形態學觀察和拍照，然后采集葉片，迅速凍于液氮中后放置于-80 ℃冰箱，用于測定各項生理指標，3株為1個處理，每個處理設3次重復。

1.2 生理指標的測定

（1）相對含水量的測定參照Pradhan等[9]的方法。

相對含水量（%）=［（鮮重-干重）/（飽和鮮重-干重）］×100

（2）相對電導率的測定。采用電導率儀DDSJ-308F測定[10]，相對電導率（%）＝（R1/R2）×100，R1表示室溫浸泡12 h所測的電導率，R2表示沸水浴30 min所測的電導率。

（3）丙二醛含量的測定。參照Sheng等[11]的方法，使用5%三氯乙酸溶液提取葉片中的丙二醛，在提取液中加入0.6%硫代巴比妥酸溶液進行顯色反應，水浴中煮沸20 min，以蒸餾水為空白在450、532、600 nm處測定吸光度值，根據以下公式計算丙二醛含量。

丙二醛含量（nmol/g）=［6.45×（A532-A600）-0.56A450］×Vt/（Vs×W）

其中Vt表示提取液總體積（mL），Vs表示測定用提取液體積（mL），W表示樣品鮮重（g）。

（4）光合特性指標的測定。葉綠素熒光參數利用OS-30P+熒光儀，選取柑橘幼苗的第5～7片真葉，用夾子夾住暗適應20 min，后將其暗反應部位暴露于660 nm固態光源下1 min，測出Fv/Fm[12]。葉綠素含量參照Mostofa等[13]的方法，有改動，取混合均勻的柑橘葉片置于離心管中，加入10 mL 80%丙酮，避光放置24～36 h至葉片變白，測定663、646、470 nm處的吸光度，對照為80%丙酮，計算葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素（葉綠素a＋葉綠素b）、類胡蘿卜素含量。

葉綠素a含量（Ca）=12.21D663-2.81D646

葉綠素b含量（Cb）=20.13D646-5.03D663

類胡蘿卜素含量（Cxc）=（1 000D470-3.27Ca-104Cb）/229

（5）滲透調節物質的測定。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[14]，脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[13]。

（6）抗氧化物質的測定。抗壞血酸和還原型谷胱甘肽含量的測定參照文獻［15］，過氧化氫酶活性測定參照Jiang等[16]的方法，過氧化物酶活性測定采用愈創木酚法[14]。

1.3 隸屬函數和主成分分析

采用徐舒等[17]的隸屬函數法對3個柑橘品種的抗寒性進行綜合評價，隸屬函數公式為：R（Xi）=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin），Xi為指標測定值（i=1，2，3，4……n），Xmin、Xmax分別為某指標的最小值和最大值。主成分分析各項生理指標參照杜培兵等[18]的方法。

1.4 數據分析

試驗數據采用Excel 2010、SPSS 22.0軟件進行統計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對柑橘幼苗形態的影響

3個柑橘品種植株表型變化特征如圖版3所示，對照（低溫脅迫0 d）植株生長正常，未出現任何癥狀。在處理第1～2 d時，‘冰糖橘’和‘砂糖橘’的植株上部嫩葉均出現萎蔫癥狀，其中‘砂糖橘’萎蔫較嚴重，而‘朱紅橘’植株外觀長勢無明顯變化；處理第3～4 d時，‘冰糖橘’和‘砂糖橘’的葉片大部分萎蔫，部分葉片出現失水現象，‘朱紅橘’上部嫩葉相繼出現萎蔫癥狀；處理第5～6 d時，植株的受害癥狀加重，其中以‘砂糖橘’較為嚴重，其次是‘冰糖橘’，‘朱紅橘’僅頂端葉片有較明顯傷害。

2.2 低溫脅迫對柑橘幼苗葉片細胞膜損傷的影響

由圖1-A可以看出，3個柑橘品種幼苗葉片相對含水量經脅迫處理后均呈逐漸下降的趨勢，其中‘砂糖橘’于處理第4 d最先達到最小值，較對照（低溫脅迫0 d）降低了48.29%，而‘冰糖橘’‘朱紅橘’處于緩慢降低的趨勢，于處理第6 d降至最低。

低溫脅迫下，3個柑橘品種幼苗葉片相對電導率均呈逐漸升高的趨勢（圖1-B），均在處理結束時達到最高值，分別較其對照增長了168.65%、115.11%、220.34%，差異均達顯著水平，說明低溫脅迫使細胞膜通透性增加，電解質泄露。

如圖1-C所示，‘冰糖橘’‘朱紅橘’丙二醛含量均呈先降低后升高的趨勢，均在處理第1 d下降至最低，從第2 d時開始增加；而‘砂糖橘’的丙二醛含量則呈逐漸升高的趨勢。至脅迫結束時，3個柑橘品種分別較對照增加了45.73%、23.81%、58.95%，差異均達顯著水平。

圖1 低溫脅迫下3個柑橘品種幼苗細胞膜損傷的變化

2.3 低溫脅迫對柑橘幼苗葉片光合特性的影響

Fv/Fm是PSⅡ最大光能轉換效率。由圖2-A可以看出，‘冰糖橘’‘朱紅橘’和‘砂糖橘’3個柑橘品種幼苗葉片Fv/Fm均隨脅迫時間的延長而降低，至脅迫結束時分別較對照降低了60.38%、68.00%、78.37%，差異均達顯著水平。如圖2-B、C所示，3個柑橘品種的總葉綠素含量、類胡蘿卜素含量均在處理第1～3 d降低，并在處理第3 d達到最低值，均以‘冰糖橘’變化幅度最大，與對照相比分別降低了37.91%、34.12%。由于處理溫度并沒有完全破壞光合色素合成，使3個柑橘品種的總葉綠素、類胡蘿卜素含量在處理第4～5 d又出現了不同程度的升高，因此，光合色素含量整體表現出先下降后升高的趨勢。

圖2 低溫脅迫下3個柑橘品種幼苗葉綠熒光參數和葉綠素含量的變化

2.4 低溫脅迫對柑橘幼苗葉片滲透調節物質的影響

如圖3-A所示，低溫脅迫下，‘冰糖橘’的可溶性糖含量呈S形曲線增加；而‘朱紅橘’和‘砂糖橘’則呈先降低后升高的趨勢，二者在處理第1 d時與對照相比顯著降低了27.01%、29.48%，之后其可溶性糖含量隨著脅迫時間的延長而升高。處理第6 d，‘冰糖橘’‘朱紅橘’和‘砂糖橘’的可溶性糖含量均達最高，分別較對照增加了97.97%、75.84%、107.42%，差異均達顯著水平。‘冰糖橘’和‘朱紅橘’的脯氨酸含量均呈先下降后上升的趨勢，在處理第1 d略有降低，后逐漸上升，而‘砂糖橘’呈逐漸上升的趨勢。與對照相比，‘朱紅橘’的脯氨酸含量增幅最大，達120.87%（圖3-B）。

圖3 低溫脅迫下3個柑橘品種幼苗滲透調節物質的變化

2.5 低溫脅迫對柑橘幼苗葉片抗氧化系統的影響

在低溫脅迫下，3個柑橘品種幼苗葉片抗壞血酸、還原型谷胱甘肽含量總體均呈下降趨勢（圖4-A、B），相比于抗壞血酸含量的變化，還原型谷胱甘肽含量整體變化幅度較小。處理第1 d，3個柑橘品種葉片抗壞血酸含量均顯著降低，而還原型谷胱甘肽含量僅‘冰糖橘’出現顯著降低，在處理結束時，與對照相比，‘冰糖橘’‘朱紅橘’和‘砂糖橘’的抗壞血酸含量分別降低了67.81%、69.69%、68.42%，還原型谷胱甘肽含量分別降低了5.74%、1.47%、4.67%。

如圖4-C所示，3個柑橘品種的過氧化氫酶活性均呈下降趨勢。處理第1 d，‘砂糖橘’的過氧化氫酶活性顯著降低，而‘冰糖橘’和‘朱紅橘’的過氧化氫酶活性升高，于處理第2 d開始降低。當脅迫持續至第6 d時，‘砂糖橘’的降幅最大，為29.10%，‘朱紅橘’次之，‘冰糖橘’降幅最小。

由圖4-D可以看出，‘砂糖橘’的過氧化物酶活性在處理第4 d有顯著上升，后呈下降趨勢，說明在處理第4 d酶抵御脅迫的能力達最大，之后酶活性逐漸減小。而‘冰糖橘’和‘朱紅橘’的過氧化物酶活性整體呈逐漸增加的趨勢，在處理第6 d時分別較對照增加了24.39%、53.65%，差異均達顯著水平。

圖4 低溫脅迫下3個柑橘品種幼苗抗氧化系統的變化

2.6 柑橘幼苗葉片的綜合比較與主成分分析

采用隸屬函數法對3個柑橘品種幼苗葉片的抗寒性進行綜合性評價，通過計算各項生理指標的隸屬函數值，得到平均隸屬函數值，平均隸屬函數值越高，抗寒性越強。結果如表1所示，平均隸屬函數值以‘朱紅橘’最大（0.486），其次是‘冰糖橘’（0.447），‘砂糖橘’最小（0.436），所以3個柑橘品種幼苗葉片的抗寒性由強到弱依次為‘朱紅橘’＞‘冰糖橘’＞‘砂糖橘’。

表1 低溫脅迫下3個柑橘品種幼苗生理指標的隸屬函數值

使用SPSS 22.0軟件對3個柑橘品種的12個生理指標進行主成分分析。如表2所示，僅提取特征值大于1的主成分，前2個主成分特征值大于1，方差貢獻率分別為67.894%、32.106%，累積貢獻率超過85%，說明前2個主成分能夠較好地代替上述12個生理指標來評價柑橘的抗寒性。

表2 主成分的特征值及貢獻率

根據表3可知，決定第1主成分的主要是相對電導率、相對含水量、可溶性糖含量，決定第2主成分的主要是過氧化氫酶活性。

3 討論與結論

葉片是植物進行光合作用和蒸騰作用的主要部位，當植物受到脅迫時，葉片會出現卷曲、枯萎、脫水等現象[19]。形態特征的變化是植物受到傷害的直觀表象，因此可根據這些現象對植株進行抗寒性評價[20]。本研究結果顯示，低溫脅迫對‘砂糖橘’傷害最嚴重，其次是‘冰糖橘’，‘朱紅橘’僅頂端葉片受到明顯傷害，說明抗寒性強，與隸屬函數法值結果一致。

表3 主成分的載荷矩陣

相對含水量是衡量植物含水量的重要指標，在脅迫條件下，植物內的相對含水量隨著脅迫程度的增加而降低[21]。本研究結果顯示，3個柑橘品種幼苗葉片相對含水量在低溫脅迫下均呈逐漸降低趨勢，其中‘砂糖橘’最先達到最小值，表明‘砂糖橘’受低溫脅迫嚴重，保水能力較差。‘冰糖橘’與‘朱紅橘’在處理第5、6 d時略有回升，這可能與蒸騰作用減少有關，該結果與簡營等[22]研究結果一致。

植物在遭受逆境脅迫時，細胞膜的完整性會被破壞，導致細胞內電解液發生泄露[23]。有研究報道，在低溫脅迫下，抗寒能力越弱的植物細胞膜透性越大，相對電導率就越高[24]。在本研究中，3個柑橘品種的相對電導率均呈上升趨勢，其中以‘砂糖橘’上升幅度最大，‘朱紅橘’最小，表明低溫脅迫使柑橘葉片的細胞膜結構受到了不同程度的損害。丙二醛是植物響應外界變化而進行膜脂過氧化的產物，對細胞有毒性[25]。令凡等[26]對不同油橄欖品種在溫度脅迫下的生理響應研究表明，植物的抗寒能力與丙二醛含量呈負相關，即抗寒能力越弱，丙二醛含量越高。本研究中，3個柑橘品種的丙二醛含量均呈逐漸升高的趨勢，說明低溫脅迫使柑橘植株遭受到損害，且‘砂糖橘’的變化幅度最大，說明過氧化程度最大，表現出較弱的抗寒能力。

光合作用是植物生存的基礎，逆境對光合作用產生的影響可通過葉綠熒光參數反映出來，Fv/Fm就是其中重要的參數，與衡量植株受脅迫損害程度密切相關[27]。在本研究中，3個柑橘品種幼苗葉片Fv/Fm均隨脅迫時間的延長逐漸降低，說明光反應中心受到了低溫脅迫的損害，導致光能轉化能力下降，該結果與周建等[28]的研究一致。葉綠素是植物細胞內參與光合作用的重要色素，朱鵬錦等[29]研究低溫對4個甘蔗品種葉片光合生理特性的影響中發現，各品種在低溫下的葉綠素含量也相應下降，且耐寒性強的品種葉綠素含量比耐寒性弱的品種高。但在本研究中，3個柑橘品種幼苗葉片葉綠素含量均出現先降低后升高的現象，如侯禎丹等[30]所述，這可能是由于在脅迫處理前期柑橘幼苗葉片光合作用降低，葉綠素合成受制，導致葉綠素含量降低，但處理溫度沒有完全破壞葉綠素合成，隨著脅迫時間的延長又出現了不同程度的增高。

植物可通過滲透調節物質來調節體內細胞液濃度以適應外界環境的變化，可溶性糖和脯氨酸作為植物體內重要的滲透調節物質，可降低細胞水勢，增加細胞穩定性，與抗逆性密切相關[31]。本研究中，3個柑橘品種葉片可溶性糖含量和脯氨酸含量，在低溫脅迫下均表現出不同程度的增加，體現了3個柑橘品種為抵抗低溫脅迫，主動生成調節物質以適應環境的改變。馬英等[32]研究表明，耐冷性強的植物產生的脯氨酸含量高于耐冷性弱的植物，在本研究中‘朱紅橘’的脯氨酸含量變化幅度最大，增長量最多，說明具有較強的抗寒能力。

植物受到外界脅迫時，可通過抗氧化系統來維持體內活性氧的平衡，減輕脅迫造成的傷害，保證植株生長發育[33]。抗氧化系統包括2個方面，一是抗氧化物質，如抗壞血酸、還原型谷胱甘肽，可通過AsA-GSH循環清除H2O2；二是抗氧化酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶，可直接把H2O2分解為H2O和O2，從而降低活性氧對植物的傷害[34]。本研究中，3種柑橘葉片的抗壞血酸含量和還原型谷胱甘肽含量均呈下降趨勢，這意味著低溫脅迫在一定程度上破壞了柑橘的防御系統，活性氧積累增加，是其受低溫傷害的重要原因之一，但還原型谷胱甘肽含量的變化幅度總體不大，且在低溫脅迫后的含量均高于抗壞血酸含量，說明在受到脅迫后，3個柑橘品種的還原型谷胱甘肽清除活性氧的能力強于抗壞血酸，這一結果與孔廣紅等[35]研究結論一致。在酶的測定中，脅迫處理均導致過氧化氫酶和過氧化物酶活性變化，說明柑橘幼苗葉片通過提高抗氧化酶活性來清除體內的活性氧，改善脅迫帶來的損害，但脅迫的加劇超出了植物自身的承受范圍，酶活性則會下降，下降程度越大，受損害越嚴重，這與李桂榮等[36]研究結果一致。

本試驗利用隸屬函數法綜合評價了3個柑橘品種的抗寒性，‘朱紅橘’的抗寒性最強，‘砂糖橘’最弱，表明柑橘抗寒性與地理分布密切有關，低緯度地區植物耐低溫能力低于高緯度地區植物，這一現象在油茶[19]的研究中也有反映。另一方面，‘砂糖橘’在種植過程中長時間抵御低溫的能力弱，易受低溫天氣的影響，因此在冬季應及時做好防凍保護措施，避免造成巨大的經濟損失。同時主成分分析表明，相對電導率、相對含水量、可溶性糖含量和過氧化氫酶活性可作為柑橘抗寒性分析的重要指標，其中相對電導率代表性最強，可為研究柑橘和實生苗等方面提供一些參考。本研究結果不僅為篩選柑橘抗寒性品種提供了理論支持，在今后柑橘的生產和栽培中有重要意義，還為進一步研究柑橘在低溫脅迫下的生理機制提供了依據，但抗凍性不同的柑橘品種間的分子水平差異，還有待進一步探究。