微生物菌劑施用對煙田根際土壤菌群數量的影響

唐興貴 陸新莉 雷庭 郭光東 江彤 丁婷

摘要 ? ?在前期篩選出高效防治煙草青枯病的生防菌株的基礎上，于貴州省黔南州獨山縣開展田間小區試驗，分析生防菌劑施用對根際土壤微生物菌群數量變化的影響。結果表明，煙草內生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04等2種生防菌劑在煙草種植中的施用均可明顯提高根際土壤微生物的菌群總數量，且LSN02的效果優于LLGJ04;其中，用煙草內生菌LSN02高濃度（2×108 CFU/mL）處理煙株時，可顯著增加根際土壤細菌菌群數量，而用煙草根際菌LLGJ04中濃度（1×108 CFU/mL）和低濃度（0.5×108 CFU/mL）處理煙株時，可分別增加根際土壤放線菌及真菌的菌群數量。

關鍵詞 ? ?微生物菌劑;根際土壤;真菌;細菌;放線菌;煙田

中圖分類號 ? ?S572.01 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）22-0086-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

煙草是貴州省重要的經濟作物。近年來，由于煙草多年連作、農業生態平衡遭到破壞等原因，導致貴州主要煙區青枯病危害日趨嚴重，成為影響煙草產業發展的主要障礙[1-3]。化學農藥的使用在煙草病害防治上發揮了重大作用，很多病害得到了暫時控制，但化學藥劑的大量持續性使用易造成病原菌抗藥、環境污染、生態失衡、藥害植株和煙葉農藥殘留等難以克服的問題，不利于生態環境的保護和農業可持續發展[4]。隨著農作物病害防治技術的進步，煙草青枯病的生物防治日益引起社會的重視。目前，圍繞煙草植物內生菌及其根際微生物控制煙草青枯病已成為研究的熱點和重點[5-8]。

微生物菌劑是指一類含有特定微生物活體的制品，可通過其所含微生物的生命活動，改善土壤質量，協調植株對養分的吸收，促進植物生長，提高產量，改善農產品品質及農業生態環境[9-10]。本課題組前期研究中，自貴州省黔南州煙區的健康煙株及根際土壤中分離獲得2株對煙草青枯病菌具有較好拮抗活性的菌株LSN02和LLGJ04，其盆栽試驗均表明煙草內生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04均可有效增強煙株對青枯病的抗病能力[11]。因此，該試驗擬在前期篩選出高效防治煙草青枯病害生防菌株的基礎上，通過田間試驗比較生防菌劑施用對土壤微生物數量以及微生物功能多樣性的影響，以期為提高植煙土壤有機養分含量和微生物活性提供依據。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗地概況

試驗在貴州省黔南州獨山縣開展，選擇2017年土傳病害重病地自然誘發。試驗地面積≥1 333.34 m2，田塊形狀相對較規則，基本呈長方形。常規條件栽培，土壤肥力中等，生產措施按常規管理實行。

1.2 ? ?試驗材料

1.2.1 ? ?供試煙草品種。選擇當地主栽煙草品種云煙87，共計2 000株。

1.2.2 ? ?供試菌株。選用本實驗室前期分離的2株對煙草青枯病菌具有較好拮抗活性的煙草內生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04，均為芽孢桿菌屬微生物。

1.2.3 ? ?供試微生物菌劑和化學藥劑。100億CFU/g多粘類芽孢桿菌（500 g/袋），由廈門多多科技有限公司生產;農用鏈霉素可溶性粉劑（15 g/袋），由華北制藥河北華諾有限公司生產。

1.2.4 ? ?供試培養基。PDA培養基（分離真菌用）：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，水1 L。NA培養基（分離細菌用）：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.5。改良高氏一號培養基（分離放線菌用）：購自試劑公司。

1.3 ? ?試驗設計

設9個處理，即煙草內生菌LSN02 0.5×108 CFU/mL灌根處理（A）、煙草內生菌LSN02 1.0×108 CFU/mL灌根處理（B）、煙草內生菌LSN02 2.0×108 CFU/mL灌根處理（C）、煙草拮抗菌LLGJ04 0.5×108 CFU/mL灌根處理（D）、煙草拮抗菌LLGJ04 1.0×108 CFU/mL灌根處理（E）、煙草拮抗菌LLGJ04 2.0×108 CFU/mL灌根處理（F）、100億CFU/g多粘類芽孢桿菌細粒劑2 700 g/hm2灌根處理（G）、72%農用鏈霉素可濕性粉劑750 g/hm2灌根處理（H），以清水灌根處理作對照（CK）。3次重復，隨機區組排列，每次重復植煙50株，共處理1 350株。

1.4 ? ?試驗過程

1.4.1 ? ?土樣采集。煙苗移栽時先蘸根，坑內灌入100 mL藥劑后再移栽，移栽后15 d左右在封窩前按同等濃度再灌1次。于煙草青枯病病情調查時采集土樣，每個小區3點取樣，采集煙株根系周圍土樣，每個樣本采集帶須根土壤50 g，牛皮紙袋裝土樣，帶回實驗室備用。

1.4.2 ? ?土壤微生物分離。稱取樣品10 g（精確到0.01 g），加入帶玻璃珠的100 mL無菌水中，靜置20 min，在旋轉式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即成土壤母液。用無菌移液管分別吸取5.0 mL上述土壤母液菌懸液，加入45 mL無菌水，按10n的比例進行系列稀釋，依次得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋倍數的土壤懸浮液。

每個樣品取3個連續適宜的稀釋度，分別吸取不同稀釋度土壤懸浮液0.1 mL，加至預先制備好的固體培養基平板上，用涂布棒在培養基表面將懸浮液來回推散涂抹均勻。每一個稀釋度3次重復，于適宜的條件下培養。

細菌培養24 h后計數，真菌培養72 h后計數，放線菌培養7 d后計數。以出現20～300個菌落數的稀釋度的平板為計數標準，統計分離到的活菌數目。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?不同處理煙田土壤中細菌的分離數量

如表1所示，不同處理煙田土壤中分離到的細菌數量有一定差異，細菌數量由多到少依次為處理C>處理F>處理E>處理B>處理D>處理A>處理G>處理H>CK。處理A、B、C、D、E、F的煙田土樣分離到的細菌數量均高于處理G、H、CK，且處理A、B、C效果較為明顯。由上述結果可知，將2種微生物菌劑添加到土壤中，在一定程度上均可引起煙田土壤細菌菌群數量的增加。

2.2 ? ?不同處理煙田土壤中放線菌的分離數量

如表1所示，不同處理煙田土壤中分離到的放線菌數量差異較大，數量最多的是處理E，分離到的放線菌數量為3.27×106個/g;其后依次是處理F、B，分離到的放線菌數量分別為2.37×106個/g和2.27×106個/g。與此同時，處理A、C、G、H等4個處理組分離到的放線菌數量均低于CK，處理H的土壤中放線菌數量僅為0.37×106個/g。由此可知，處理F、E、B均能增加土壤中放線菌數量，其中處理E效果最為明顯。

2.3 ? ?不同處理煙田土壤中真菌的分離數量

如表1所示，不同處理煙田土壤中分離到的真菌數量以處理G最多，為3.77×106個/g;其后依次是處理D>處理B>處理E>處理C>處理H>處理A>處理F>CK。由此可知，高濃度微生物菌劑的添加，在一定程度上抑制了土壤中真菌的生長，隨著菌劑濃度的降低，土壤中的真菌數量相對于CK反而增加，表現為處理D、B對根際土壤的真菌含量有明顯的增加效果。

2.4 ? ?不同處理煙田土壤中分離的微生物總數量

如表1所示，處理C樣品中分離到的微生物總量最高，數量為2.78×107個/g，其后分別為處理F、E;而處理H土壤中分離到的微生物總數量則低于CK及其他各處理，說明微生物菌劑的添加可明顯增加根際土壤的微生物菌群數量，而化學藥劑的施用在一定程度上對土壤中的微生物群落起到破壞作用。

3 ? ?結論與討論

近年來，隨著化學肥料在作物生產中引起的土壤板結、土壤微生物區系失衡、土傳病害發生及環境污染等問題的日益加重[12]，微生物菌劑在農業上的作用已逐漸被人們認識，并有多種微生物菌劑，如蠟質芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌以及哈茨木霉等的開發應用。大量研究表明，微生物菌劑可通過其有效微生物的生命活動增加土壤養分、促進作物生長、維持根際間微生物區系平衡，可以通過微生物之間或與植物之間的互作增強植物的抗病與抗逆能力。該研究在前期篩選出高效防治煙草青枯病的生防菌株的基礎上，通過田間試驗比較生防菌劑施用對土壤微生物數量以及微生物功能多樣性的影響，發現煙草內生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04 2種生防菌劑在煙草種植中的施用均可明顯提高土壤微生物的菌群總數量。結合前期研究，LSN02具有趨化特性，用中濃度（1×108 CFU/mL）、高濃度（2×108 CFU/mL）的LSN02菌株處理煙株，煙草青枯病的病株率顯著低于LLGJ04菌株不同濃度處理組[11]。因此，推測將煙草內生菌LSN02施用到煙草根部，LSN02能快速向根系移動，通過增加植株根際土壤中的細菌菌群數量，從而與青枯病菌進行空間及營養等方面的競爭，反映到外部癥狀上，即LSN02菌劑的施用可明顯減輕煙草植株青枯病的發病率。

土壤微生物是土壤生物特性的重要組成部分，在土壤營養轉化循環、有機質分解等方面起著重要作用，是土壤肥力的一個重要指標，其數量變化可反映出土壤環境變化，體現微生物活性變化。該研究中，微生物菌劑的添加能明顯增加植煙土壤中微生物數量。究其原因，將微生物菌劑添加入煙草根際，隨著微生物的生長代謝，在一定程度上改變了土壤中的C/N比值，間接影響土壤微生物生長繁殖，反映在土壤微生物的分離結果上則是施入微生物菌劑的煙草土壤分離到的真菌、細菌以及放線菌含量均有不同程度的增加。

4 ? ?參考文獻

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