中草藥對兔球蟲卵囊體外發育的影響

方素芳 劉康雅 崔平 蘇杰 褚耀誠 馬利芹 魏香蒲

摘要 ? ?為探討白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍、秦皮、石榴皮、板藍根、黃檗、檳榔、馬齒莧等12種中草藥水煎劑對兔球蟲卵囊孢子化的影響，選用100%、50%、25%不同濃度的單味藥物對未孢子化的兔球蟲進行體外抑制試驗，于第3、5天分別計數。然后洗去中藥組的藥液，加等量2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續培養3 d，計算每組卵囊的孢子化率。結果表明，所選用的12種中草藥中白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍的3個濃度均可以明顯抑制卵囊孢子化;而石榴皮、馬齒莧、板藍根僅100%濃度對抑制球蟲卵囊有一定效果;常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔抑制球蟲卵囊孢子化的作用效果不明顯。洗去中藥后，只有100%、50%濃度的絞股藍有部分卵囊沒有孢子化，白頭翁、南瓜子、柴胡、馬齒莧組兔球蟲在重鉻酸鉀環境中仍可繼續生長，說明單味中藥對卵囊只能抑制其發育而不能有效殺滅，即脫離中藥環境，兔球蟲仍可繼續發育。

關鍵詞 ? ?中草藥;兔球蟲;體外發育;孢子化;抑制作用

中圖分類號 ? ?S829.1 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）22-0176-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

傳統的兔球蟲病防治方法多為藥物防治，但是面臨日益嚴重的困難和挑戰，兔球蟲像其他球蟲一樣很容易產生耐藥性蟲株，致使新生產的抗球蟲藥在使用很短的一段時間后即產生抗藥性而失去使用價值，抗球蟲藥很難長期占據市場。藥物的殘留以及對環境的污染，給食品工業安全生產和人民衛生健康帶來嚴重威脅，找到防治球蟲病的新方法是養殖業者和防制專家共同追求的目標。周新銳等[1]、常曉輝等[2]報道，雞球蟲對中草藥不易產生耐藥性，毒副作用小，具有廣闊的發展前景。但是目前中草藥的利用大多數為體內用藥階段，關于中草藥對球蟲卵囊體外發育的影響報道較少[3]。為此，本研究選取南瓜子、柴胡、白頭翁等12種中藥進行體外抑制兔球蟲卵囊孢子化試驗，以期為新型兔球蟲消毒劑的研發及新型抗球蟲中藥的研究提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

中草藥：白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍、秦皮、石榴皮、板藍根、黃檗、檳榔、馬齒莧等12種中草藥，均購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，采用煎煮法制成含生藥 1 g/mL的提取液，備用。

兔球蟲卵囊：選用孔氏艾美耳球蟲卵囊，由河北北方學院獸醫寄生蟲實驗室提供，試驗前通過人工感染無球蟲兔進行復壯，獲得新鮮未孢子化球蟲卵囊，備用。

1.2 ? ?試驗設計

在光口瓶中分別加入濃度100%、50%、25%的白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍、秦皮、石榴皮、板藍根、黃檗、檳榔、馬齒莧等不同濃度的湯劑40 mL。另外設2瓶2.5%重鉻酸鉀溶液40 mL作為對照，于每個光口瓶中均加入4×106未孢子化球蟲卵囊，放入振蕩培養箱（HZQ-F160）中，在27 ℃條件下進行培養，于第3、5天分別計數。然后洗去中藥組的中藥液，加等量2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續培養3 d，計算每組卵囊的孢子化率。

1.3 ? 中藥制劑制備

稱取白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍、秦皮、石榴皮、板藍根、黃檗、檳榔、馬齒莧各40 g制成湯劑。具體方法為：以白頭翁為例，稱取白頭翁40 g，加入350 mL蒸餾水浸泡20 min，文火煮30 min，過濾，濾渣再加350 mL蒸餾水，文火煮30 min，過濾，合并二次濾液，加熱濃縮至40 mL，制成100%中藥湯劑（即1 mL溶液含有1 g干物質），高壓滅菌，備用。其他幾種藥液制備方法與白頭翁的制備方法相同。按照試驗設計，用時配成不同濃度的湯劑。

1.4 ? ?卵囊孢子化率計算

分別在培養3、5、8 d后進行孢子化卵囊的計數，取1滴卵囊和藥液的混懸液在載玻片上并于10×40倍數的顯微鏡下進行觀察，隨機數100個球蟲卵囊，記錄其中已經孢子化的卵囊數量，從而得出其孢子化率。計算公式如下：

卵囊孢子化率（%）=孢子化卵囊數/100個卵囊×100。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?單味中藥作用3 d對兔球蟲卵囊孢子化率的影響

將本試驗的12種中草藥制備成3個濃度的湯劑，研究其對兔球蟲卵囊孢子化的抑制差異。結果發現，白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍的3個濃度均可以明顯抑制卵囊的孢子化;而石榴皮、馬齒莧、板藍根僅100%濃度對抑制球蟲卵囊有一定效果;常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔抑制球蟲卵囊孢子化的作用效果不明顯（表1）。

2.2 ? ?單味中藥作用5 d對兔球蟲卵囊孢子化率的影響

不同濃度單味中藥作用5 d對兔球蟲卵囊孢子化的影響，與不同濃度單味中藥作用3 d對兔球蟲卵囊孢子化的影響結果差異不明顯，白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍的3個濃度均可以明顯抑制卵囊的孢子化;石榴皮、馬齒莧、板藍根僅100%濃度對抑制球蟲卵囊有一定效果;常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔對球蟲卵囊孢子化抑制不明顯（表2）。

2.3 ? ?洗去中藥后兔球蟲卵囊孢子化率的變化

單味中藥作用5 d后，洗去中藥組的中藥液，加等量 2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續培養3 d，計數，觀察兔球蟲卵囊的孢子化率。結果發現，具有明顯抑制卵囊孢子化的中藥組，洗去中藥之后，只有100%、50%濃度的絞股藍有部分卵囊沒有孢子化，白頭翁、南瓜子、柴胡、馬齒莧組兔球蟲在重鉻酸鉀環境中仍然可以繼續生長。這說明單味中藥對卵囊只能抑制其發育而不能有效殺滅，即脫離中藥環境，兔球蟲仍然可以繼續發育（表3）。

3 ? ?結論與討論

3.1 ? ?單味中藥抑制兔球蟲卵囊孢子化的效果

本試驗設3個濃度研究12種中草藥湯劑對兔球蟲卵囊孢子化的抑制效果。結果發現，白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍的3個濃度均可以明顯抑制卵囊的孢子化，兔球蟲孢子化率為0～7%。劉 ?陽等[4]用100%濃度、50%濃度、25%濃度白頭翁湯劑培養3 d，兔球蟲孢子化率分別為85%、70%、60%;張國[5]用100%濃度、50%濃度、25%濃度白頭翁湯劑培養4 d，兔球蟲孢子化率分別為36%、46%、47%;張文香等[6]用100%濃度、50%濃度、25%濃度白頭翁湯劑培養4 d，雞球蟲孢子化率分別為13%、14%、15%;高俊峰等[7]用100%濃度、50%濃度、25%濃度柴胡湯劑培養，兔球蟲孢子化率分別為32%、33%、35%。

本文中石榴皮、馬齒莧、板藍根僅100%濃度對抑制球蟲卵囊有一定效果，兔球蟲孢子化率為3%～53%。劉 ?陽等[4]用100%濃度、50%濃度、25%濃度石榴皮湯劑培養3 d，兔球蟲孢子化率分別為75%、81%、80%。

文中常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔對抑制球蟲卵囊孢子化作用效果不明顯，兔球蟲孢子化率為87%～98%。不同濃度單味中藥作用3、5 d對兔球蟲卵囊孢子化的影響結果差異不明顯。劉 ?陽等[4]用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養3 d，兔球蟲孢子化率分別為76%、83%、76%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度秦皮湯劑培養3 d，兔球蟲孢子化率分別為49%、61%、55%。張國[5]用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養4 d，兔球蟲孢子化率分別為60%、64%、72%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度秦皮湯劑培養4 d，兔球蟲孢子化率分別為63%、65%、68%。張文香等[6]用100%濃度、50%濃度、25%濃度常山湯劑培養4 d，雞球蟲孢子化率分別為26%、29%、40%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度秦皮湯劑培養4 d，雞球蟲孢子化率分別為12%、14%、16%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養4 d，雞球蟲孢子化率分別為13%、19%、24%。高俊峰等[7]用100%濃度、50%濃度、25%濃度常山湯劑培養，兔球蟲孢子化率分別為35%、37%、39%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養，兔球蟲孢子化率分別為37%、42%、45%。

本研究結果與劉陽、高俊峰等的結果存在差異，分析原因可能是所用的兔球蟲蟲種不同。同時，中草藥能抑制卵囊孢子化過程，使其孢子化率降低或延遲其孢子化時間，原因可能是因為一些中草藥的藥物成分能穿透卵囊壁引起抑制、殺滅作用，或是球蟲卵囊對部分藥性成分敏感因而致孢子化率降低[8]。中草藥對兔球蟲卵囊的作用機理仍有待研究。

3.2 ? ?單味中藥殺滅兔球蟲卵囊的效果

單味中藥作用5 d后，洗去中藥液，加等量2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續培養3 d。結果發現，只有100%、50%濃度的絞股藍有部分卵囊沒有孢子化，白頭翁、南瓜子、柴胡、馬齒莧組兔球蟲在重鉻酸鉀環境中仍可繼續發育，這說明單味中藥對卵囊只能抑制其發育而不能有效殺滅。葛 ?凱等[9]選用23味不同濃度的中草藥與未孢子化卵囊進行培養，在不同時間觀察卵囊孢子化率，洗去藥物進行培養，結果表明，商陸具有較好的抑制作用，隨著時間延長，球蟲卵囊孢子化率呈現下降趨勢，且藥物濃度越高，抑制效果越好。孟新宇[10]研究發現，珍珠草、川楝子和青蒿抑制卵囊孢子化作用最為明顯，在與卵囊作用1、5、10 h后均能明顯抑制孢子化程度，但隨著作用時間的延長其卵囊孢子化率無顯著差異。王璽德等[11]報道石榴皮水提物對離體培養兔球蟲卵囊的殺滅作用藥效很好。我國中草藥資源豐富，但中草藥的活性成分和藥理作用非常復雜，篩選出具有抗球蟲活性的單味中草藥是研制抗球蟲中草藥復方制劑的必要環節。

4 ? ?參考文獻

[1] 周新銳，田志英，古少鵬，等.中草藥在雞球蟲病中的應用研究進展[J].中獸醫學雜志，2010（1）：54-57.

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[3] 馬海利，鄭明學，李遠平，等.中藥體外抗柔嫩艾美球蟲的研究[J].中國獸醫科技，2001，31（2）：25-26.

[4] 劉陽，郝桂英.6種中草藥水提取物對兔球蟲卵囊孢子化的影響[J].西昌學院學報（自然科學版），2017，32（1）：7-9.

[5] 張國.中草藥對兔球蟲卵囊孢子化的影響[J].新疆畜牧業，2012，21（7）：16-18.

[6] 張文香，張香齋，李佩國，等.中草藥對球蟲卵囊孢子化的影響[J].河北科技師范學院學報，2005，19（2）：23-25.

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[8] 李蘊玉，賈青輝，李佩國.單味中草藥對球蟲卵囊體外抑制的試驗研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2015（5）：200-202.

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[10] 孟新宇.珍珠草對E.tenella卵囊孢子化率、脫囊率及致病力的影響[D].北京：中國農業科學院，2010.

[11] 王璽德，盛書娟，祝建平，等.石榴皮提取物對離體培養兔球蟲卵囊的殺滅作用[J].中國畜牧獸醫，2012，39（2）：212-215.