超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測雞蛋中甲硝唑與地美硝唑及其代謝物殘留

王艷 王淼 劉菊才 吳艷云 徐藝芮 羅培林

摘要 ? ?建立了雞蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法。樣品經乙酸乙酯提取、液液分配和MCX固相萃取柱凈化富集后UPLC-MS/MS檢測，以乙腈和水（0.1%甲酸）為流動相，經C18（2.1×50 mm，1.8 μm）色譜柱分離后，在正離子模式下采用多反應監測模式進行測定。結果表明，甲硝唑、甲硝唑代謝物產物羥基甲硝唑、地美硝唑、地美硝唑代謝產物羥甲基甲硝咪唑在1.0～100 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.997 5，在1.0、5.0、20.0 μg/kg 3個濃度水平下進行加標回收試驗，平均回收率為68.1%～92.3%，RSD為3.4%～9.0%，方法檢出限為0.1 μg/kg。該方法靈敏性、準確性、穩定性好，適用于雞蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留的定性和定量分析，為雞蛋中硝基咪唑類藥物檢測提供一定的技術參考。

關鍵詞 ? ?甲硝唑;地美硝唑;代謝物;雞蛋;超高效液相色譜-串聯質譜

中圖分類號 ? ?O657.63;TS251.55 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）22-0191-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

甲硝唑、地美硝唑是人工合成硝基咪唑類藥物，對腸道和組織的厭氧菌感染、家禽的滴蟲病感染、雞生殖系統疾病等療效好[1]，因而常被添加于飼料中，用于改善飼料轉化率[2]。硝基雜環類化合物是引起細胞誘變的物質，硝基咪唑類藥物及其代謝產物具有潛在的動物致癌、致畸、誘變和遺傳毒性作用[3]，其殘留對動物性食品構成了威脅。《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規定甲硝唑、地美硝唑允許作治療用獸藥，但不得在動物性食品中檢出[4]。日本規定甲硝唑、地美硝唑在食品中不得檢出，歐盟和美國均規定了甲硝唑、地美硝唑為禁用獸藥[5-6]。

我國已制定了一些針對硝基咪唑類藥物的檢測標準，但鮮見雞蛋中硝基咪唑類藥物的檢測。現有的國家標準與文獻研究的基質多集中在畜禽類組織、飼料、蜂蜜等方面，對雞蛋中硝基咪唑類藥物多組分殘留及代謝物研究甚少。本試驗針對雞蛋的基質特點，對樣品提取、凈化條件進行優化，利用液相色譜-串聯質譜技術建立了雞蛋中甲硝唑（Metronidazole MNZ）、地美硝唑（Dimetridazole DMZ）、甲硝唑代謝產物羥基甲硝唑（Metronidazole-OH MNZOH）、地美硝唑代謝產物羥甲基甲硝咪唑（2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-1H-imidazole HMMNI）殘留同時檢測的方法。該方法靈敏度高，重現性好，適合大批量樣品檢測。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?儀器與設備

1290-6460高效液相色譜-四級桿串聯質譜聯用儀，美國Agilent公司;Milli-Q超純水儀，美國密理博公司;旋轉蒸發儀，德國IKA公司;高速離心機，湖南湘儀公司;氮吹儀。

1.2 ? ?材料與試劑

甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑標準品，濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純，Fisher公司;其他試劑均為分析純試劑;試驗用水為超純水;Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL），美國Waters公司。

1.3 ? ?試驗方法

1.3.1 ? ?溶液配制。標準溶液的配制：吸取100 μg/mL標準溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成質量濃度為10 μg/mL的標準溶液，-20 ℃下保存。標準中間使用液的配制：吸取10 μg/mL標準溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成質量濃度為1 μg/mL的標準溶液，-20 ℃下保存。基質標準工作液：吸取一定量的標準中間使用液，用空白樣品提取液配制成基質混合標準工作液。

1.3.2 ? ?樣品制備。雞蛋去殼，放入容器，用勻漿機將樣品攪拌混勻，裝入潔凈樣品盒中，-20 ℃以下保存，試驗前解凍混勻稱樣。

1.3.3 ? ?提取。稱取2.0 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL塑料離心管中，加入15 mL乙酸乙酯2 500 r/min渦動5 min，6 000 r/min離心5 min，上清液轉移至雞心瓶中，殘渣再用10 mL乙酸乙酯提取1次，合并2次提取液，35 ℃水浴下旋轉濃縮至干后加入0.1 mol/L鹽酸溶液，充分溶解殘渣，再加入5 mL正己烷，充分混勻，轉移至15mL塑料離心管中，6 000 r/min離心5 min，去除上層正己烷層，下層備用。

1.3.4 ? ?凈化。MCX固相萃取柱使用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液活化平衡后，加入備用液，然后依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、3 mL甲醇、3 mL 2%氨水-甲醇（9∶1，體積比）淋洗并擠干，5%氨水-甲醇（2∶3，體積比）3 mL洗脫，洗脫液于35 ℃氮氣吹至1 mL以下，0.1 mol/L甲酸溶液-乙腈（9∶1，體積比）定容至1.0 mL，混勻后過0.22 μm有機微孔濾膜，供LC-MS/MS檢測。

1.3.5 ? ?儀器條件。色譜條件：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18（Rapid Resolution HD 2.1×50 mm，1.8 μm）;流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量2 μL;流動相A為水（0.1%甲酸），流動相B為乙腈;梯度洗脫程序見表1。

質譜條件：離子源AJS-ESI;毛細管電壓4 000 V;霧化氣壓力0.31 MPa;干燥氣溫度300 ℃;干燥氣流量5 L/min;鞘氣流量11 L/min;鞘氣溫度250 ℃;噴嘴電壓0 V;離子極性正;質量掃描模式MRM。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?質譜條件優化

選擇ESI（+）的電離模式下對目標物進行一級質譜分析，確定各目標物的分子離子峰，均為[M+H]+型。以分子離子峰作為母離子作二級質譜掃描，并進行質譜條件優化，選取離子豐度較高、干擾小的2個碎片離子作為目標物的定性和定量離子。甲硝唑、地美硝唑及其代謝物的母離子、定性和定量離子及碰撞能見表2。標準溶液提取離子流圖見圖1。

2.2 ? ?提取方法的選擇

甲硝唑在水中微溶，而地美硝唑不溶于水但能溶于稀酸，在乙腈和乙酸乙酯中溶解性均較好。試驗選取乙酸乙酯和乙腈為提取溶劑并進行比較。結果表明，乙腈沉淀蛋白作用良好，能形成致密的蛋白質沉淀，但提取雜質多，提取液旋蒸濃縮時間長，0.1 moL/L鹽酸溶液溶解殘渣時雜質易析出，且極易堵塞凈化柱。從5 μg/kg的添加回收效果來看，乙腈作為提取溶劑時對甲硝唑和地美硝唑的回收率低于70%，對羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的回收率不足50%。而乙酸乙酯作提取溶劑時，提取雜質較少，旋蒸濃縮過程平穩、時間短，并有利于正己烷脫脂，對各目標物回收效果均理想。因此，選提取效率高的乙酸乙酯作提取溶劑。

2.3 ? ?固相萃取小柱的選擇

試驗考察了Oasis HLB、Oasis MCX、Agela Cleanert SCX、Agela Cleanert PCX 4種萃取小柱對各目標物的回收率（添加量為5 μg/kg）差異。結果表明，MCX、PCX、SCX萃取柱對甲硝唑、地美硝唑、羥甲基甲硝咪唑回收良好，回收率無顯著差異，但MCX萃取柱對羥基甲硝唑的回收率優于PCX、SCX萃取柱，而HLB萃取柱對4種化合物回收率均偏低。因此，選用MCX萃取小柱為凈化柱（圖2）。

2.4 ? ?線性范圍、線性方程與檢出限

以空白基質液配制標準曲線，采用標準添加法評價方法的檢出限。標準曲線的系列質量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100 ng/mL，以目標化合物定量離子峰面積（Y）為縱坐標，以質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線（表3），相關系數均大于0.997 5。當空白樣品標準添加水平為0.1 μg/kg時，各化合物的信噪比（S/N）均大于3，故將各藥物方法檢出限定為0.1 μg/kg。

2.5 ? ?準確度和精密度

利用陰性雞蛋樣品通過標準添加試驗考察方法的回收率以及精密度。分別在1.0、5.0、20.0 μg/kg 3個水平添加各成分，按照試驗方法測定回收率，每個水平做6個平行性試驗，計算平行回收率與相對標準偏差，結果見表4。結果顯示，羥基甲硝唑的平均回收率為68.1%～72.0%，甲硝唑、地美硝唑、羥甲基甲硝咪唑的平均回收率為79.1%～92.3%，相對標準偏差為3.4%～9.0%，方法準確度和精密度滿足藥物殘留檢測的要求。

3 ? ?結論

本文采用超高效液相色譜串聯質譜技術建立雞蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留同時檢測的分析方法。樣品經乙酸乙酯提取、MCX固相萃取柱凈化富集后UPLC-MS/MS檢測，該法操作方便、對雞蛋基質凈化效果好、靈敏度高、專屬性強、精密度良好，可實現雞蛋樣品中硝基咪唑類藥物的分析確證。

4 ? ?參考文獻

[1] 王艷豐，張丁華.蛋雞健康養殖與疾病防治寶典[M].北京：化學工業出版社，2016.

[2] 郭禮強，張金玲，李凱，等.HPLC-MS/MS法測定飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量[J].中國獸藥雜志2017，51（1）：52-56.

[3] 丁燕玲，陳彤，黃婷.超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中甲硝唑、二甲硝唑及其代謝物的方法研究[J].廣東化工，2018，45（375）：245-248.

[4] 中華人民共和國農業農村部，國家衛生健康委員會.食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量：GB 31650—2019[S].北京：中國標準出版社，2019.

[5] 李銳，錢鳴蓉，肖英平，等.國內外水禽產品中獸藥殘留限量標準比對分析[J].農產品質量與安全，2017（6）：28-31.

[6] 宋偉，胡艷云，韓芳，等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞肉中的二氯二甲吡啶酚、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留[J].色譜，2013，31（12）：1161-1166.