TG-相互作用因子在維甲酸抑制腭突間充質細胞增殖過程中的作用

劉小轉，高素華，余凱倫，陳 瑤，陶宇昌，何志東，余增麗

1)河南省人民醫院臨床單細胞生物醫學中心 鄭州450003 2)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001

TG-相互作用因子(TG-interacting factor，TGIF)是TALE(three-amino-acid loop extension)同源域蛋白超家族分子之一[1]，是一種廣泛表達的核內轉錄抑制因子，在多種細胞和組織中均有表達。TGIF參與了多種生物的正常發育過程，它的突變、失活能引起人類胚胎的前腦無裂畸形[2-3]，其缺失可導致雄性果蠅不育[4-5]。同時，TGIF參與了多條細胞信號通路的調節，尤其是TGF-β和RA信號通路[6-8]。維甲酸(retinoic acid，RA)是維生素A的代謝產物，有順式維甲酸和全反式維甲酸 (all-trans retinoic acid,atRA)兩種異構體,其中以全反式構型最為穩定和常見。生理劑量的RA可有效調節胚胎發育的諸多過程，但過量的RA可導致包括腭裂在內的多種出生缺陷[9]。RA與核內受體RAR(α,β,γ)和RXR(α,β,γ)結合后，啟動基因轉錄，發揮生理作用[10]。TGIF能夠與RXRα結合，抑制RXRα介導的轉錄反應[9]。有文獻[11]報道，過量的atRA可導致腭裂的發生，其機制可能與抑制腭突間充質細胞的增殖和影響中嵴上皮的轉歸有關。為進一步觀察TGIF在atRA誘導的腭突間充質細胞增殖過程中的作用，作者進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1主要材料和試劑SPF級成年健康C57BL/6N近交系小鼠[購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京)2012-0001]。胎牛血清、2.5 g/L胰蛋白酶及蛋白酶抑制劑(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM/F-12培養基(美國Hyclone公司)；四甲基偶氮藍(MTT)粉劑(美國Sigma公司)；OPTI-MEM(美國Gibco公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；TGIF siRNA、對照siRNA和小鼠抗TGIF單克隆抗體 (美國Santa Cruz公司)；小鼠抗β-actin單克隆抗體、BCA蛋白試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG和 ECL發光液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)。

1.2胎鼠腭突間充質細胞的分離及培養取妊娠13 d(gestation day 13，GD13)胎鼠，在立體顯微鏡下用眼科手術器械小心取下雙側腭板，PBS清洗后剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化5 min，加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基終止消化。接種于100 mL培養瓶中，于CO2培養箱中培養，當培養瓶中細胞融合度達70%～80%時，進行細胞傳代。

1.3atRA對胎鼠腭突間充質細胞作用濃度和作用時間的篩選收集第二代對數生長期胎鼠腭突間充質細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，每孔100 μL接種于3個96孔板內。培養至細胞貼壁后，加入濃度梯度為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L的atRA，每個濃度設6個復孔，并設調零孔，終體積保持200 μL。分別培養24、48和72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續培養4 h，然后每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩30 min。在酶標儀上測定各孔490 nm處的吸光度值，記錄結果，繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。篩選atRA的最佳作用時間和適宜的作用濃度。

1.4atRA對胎鼠腭突間充質細胞內TGIF蛋白表達的影響收集第三代胎鼠腭突間充質細胞，用5 μmol/L atRA處理 72 h；以不加atRA處理的細胞為對照；每組均設3個復孔。用裂解液冰上裂解細胞，同時加入蛋白酶抑制劑，提取蛋白。采用BCA蛋白試劑盒測定所提取蛋白的濃度，并根據50 μg的上樣量計算上樣體積。然后，制膠、上樣、電泳、轉膜(調整轉膜電流為300 mA，時間約為2 h)，50 g/L脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，分別加小鼠抗TGIF單克隆抗體(按1∶500稀釋)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(按 1∶1 000稀釋)37 ℃孵育2 h，加二抗(山羊抗鼠IgG，按1∶5 000)37 ℃孵育1 h，ECL發光液顯影，用掃描儀掃描膠片，用Image J軟件統計各條帶灰度值，計算目的蛋白與內參β-actin條帶灰度值的比值，得到目的蛋白的相對表達量。

1.5TGIF siRNA轉染對胎鼠腭突間充質細胞中TGIF蛋白表達的影響收集對數期生長的第二代胎鼠腭突間充質細胞，以1.5×104個/孔接種于24孔板內，用0.5 mL含血清不含抗生素的正常培養基培養24 h。轉染步驟如下：①50 μL預熱的OPTI-MEM內加入33 nmol/L TGIF siRNA或對照siRNA，輕輕混勻。②取1.5 μL Lipofectamine 2000，用50 μL預熱的OPTI-MEM稀釋并室溫孵育5 min。③將上述兩種液體混合，用手指彈勻，室溫靜置20 min。④棄去細胞培養孔上清液，用預熱的PBS洗3遍，每孔加入400 μL預熱的OPTI-MEM，將制備好的轉染液從側壁加入，搖勻，放回培養箱中常規培養。轉染6 h后，吸出24孔板內液體，加入新的完全培養基，于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中繼續培養72 h。均以不轉染的細胞為對照。Western blot法檢測3組細胞中TGIF蛋白的表達，方法同1.4，每組設3個復孔。實驗重復3次。

1.6TGIF siRNA轉染對atRA培養的胎鼠腭突間充質細胞增殖的影響將第三代胎鼠腭突間充質細胞進行分組：空白對照組、對照siRNA組、對照siRNA+atRA組、TGIF siRNA組和TGIF siRNA+atRA組，每組設6個復孔。細胞先按照1.5的方法進行轉染，轉染6 h后，根據分組分別加入新的完全培養基或含atRA(濃度為5 μmol/L)的培養基，于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中繼續培養72 h；用MTT法檢測細胞增殖，方法同1.3。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析。將實驗所得所有數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，應用3×6 析因設計的方差分析比較不同濃度atRA處理不同時間對胎鼠腭突間充質細胞增殖的影響，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較TGIF siRNA轉染后細胞中TGIF蛋白表達量的變化以及atRA對胎鼠腭突間充質細胞增殖的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1atRA對胎鼠腭突間充質細胞增殖的影響見表1。由表1可知，0.1～10.0 μmol/L的atRA對胎鼠腭突間充質細胞的生長均有抑制作用，而且呈時間-劑量依賴性。

2.2atRA對胎鼠腭突間充質細胞內TGIF蛋白表達的影響見圖1。與對照組(0.94±0.07)相比，5.0 μmol/L atRA可明顯促進胎鼠腭突間充質細胞內TGIF蛋白的表達，表達水平達(1.30±0.06)(t=6.480，P=0.003)。

2.3TGIF siRNA對胎鼠腭突間充質細胞內TGIF蛋白表達的影響見表2。由表2可知，與對照組和對照siRNA組相比，TGIF siRNA對胎鼠腭突間充質細胞內TGIF蛋白表達的抑制率達69.7%(P<0.05)。

表1 不同濃度atRA處理不同時間對胎鼠腭突間充質細胞增殖的影響(n=3)

圖1 atRA對胎鼠腭突間充質細胞中TGIF蛋白表達的影響

表2 TGIF siRNA轉染后細胞中TGIF蛋白表達量的變化

2.4TGIF siRNA轉染對atRA處理的胎鼠腭突間充質細胞增殖的影響見表3。由表3可知，與對照siRNA組相比，atRA對胎鼠腭突間充質細胞的增殖具有明顯的抑制作用(P<0.05)。與TGIF siRNA轉染組相比，atRA對胎鼠腭突間充質細胞增殖無明顯作用(P>0.05)。

表3 5組胎鼠腭突間充質細胞增殖的比較

3 討論

參與側腭突生長發育過程的細胞主要有兩種：①中嵴上皮細胞，來源于外胚層細胞，覆蓋于融合前的腭突近中邊緣嵴。多數學者[12-13]認為MEE細胞的最終轉歸主要包括兩種形式：一是退化或凋亡；二是上皮-間充質轉化。而其轉歸形式的改變直接影響著腭突的最終融合。②腭突間充質細胞，是形成腭突的主體細胞。在腭突發育的垂直生長期和上抬期，腭突內未分化的腭突間充質細胞生長活躍。在腭發育前期，腭突間充質細胞數量在短期內快速增加以及間質成分的增加將使腭突體積迅速膨大，是在特定的時間內完成腭突的垂直生長和上抬的必要條件[14]。另外，這種細胞還參與腭部骨組織、肌肉及血管的形成，對維持腭板的正常發育起重要意義。因此，任何外源性的致畸因子干擾了腭突間充質細胞的正常增殖和分化都將導致腭突發育的異常[15]。有文獻[11]報道，過量的atRA導致腭裂的發生與抑制腭突間充質細胞的增殖和影響中嵴上皮的轉歸有關。在本研究中，為了確定atRA有效的作用濃度和作用時間，應用MTT實驗檢測了不同濃度atRA在不同時間點對腭突間充質細胞增殖的影響，結果顯示atRA對胎鼠腭突間充質細胞的增殖具有劑量-時間效應；48 h時任何濃度的aRA對胎鼠腭突間充質細胞的增殖影響并不顯著；在72 h時，5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的atRA對胎鼠腭突間充質細胞增殖的抑制才具有顯著性。因此，在后續研究中選擇atRA的作用濃度為5.0 μmol/L，作用時間為72 h。

TGIF是一種在多種細胞和組織中均有表達的核內轉錄抑制因子，它參與了多條細胞信號傳導通路的調節，尤其是TGF-β和RA信號通路[6-8]。研究[7]表明TGIF能夠與RXRα結合，從而抑制RXRα介導的轉錄反應。本研究結果顯示，在胎鼠腭突間充質細胞中，atRA可明顯促進TGIF的表達，提示TGIF在atRA作用于胎鼠腭突間充質細胞的過程中具有極其重要的作用。為了進一步明確TGIF在atRA作用于胎鼠腭突間充質細胞的過程中的作用，本研究利用TGIF siRNA轉染胎鼠腭突間充質細胞，沉默TGIF基因的表達。然后，采用Western blot檢測TGIF siRNA轉染后atRA對胎鼠腭突間充質細胞增殖的影響。結果顯示：TGIF siRNA轉染前，atRA對胎鼠腭突間充質細胞的增殖具有明顯的抑制作用；TGIF siRNA轉染后，atRA對胎鼠腭突間充質細胞增殖無明顯影響，即TGIF基因沉默后，atRA失去了對胎鼠腭突間充質細胞增殖的抑制作用。由此推斷，atRA對腭突間充質細胞的抑制作用可能主要通過TGIF介導。