基于脂質(zhì)組學(xué)方法的哮喘小鼠肺組織中甘油酯類代謝分析

張喜梅,蔣天賜,程 哲 ,代靈靈,王 茜,賈留群,景曉剛,安 琳,劉 夢,孫 迪,彭有梅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052 2)河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

哮喘是一種慢性異質(zhì)性為氣道炎癥性疾病，我國20歲及以上人群哮喘患病率為4.2%，患病人數(shù)達(dá)到4 570萬[1]。盡管大部分哮喘患者經(jīng)過正規(guī)治療后可以達(dá)到哮喘控制，但是仍有部分重癥患者由于長期大劑量激素的應(yīng)用導(dǎo)致多種并發(fā)癥，是哮喘致殘、致死的主要原因[2]。脂類是人體重要組成部分，其中甘油酯類主要有甘油二酯(diacylglycerol,DG)和甘油三酯(triglyceride,TG)。研究[3]發(fā)現(xiàn)哮喘患者血TG水平與過敏程度及呼出氣一氧化氮水平具有相關(guān)性。TG作為脂質(zhì)主要組成部分，可參與肥大細(xì)胞中脂滴的形成，脂滴經(jīng)水解后可釋放大量的花生四烯酸，可能參與哮喘的病理生理過程。但目前該方面研究仍較少，TG參與哮喘的發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究采用基于液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography/mass spectrometry,LC/MS)技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)方法研究哮喘小鼠肺組織中TG代謝情況，為下一步研究TG代謝參與哮喘的機(jī)制奠定動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物分組及處理6周齡無特定病原體(SPF)級BALB/c 雄性小鼠16只，體重(21.0±1.7) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(動物質(zhì)量證書編號：114007003)。動物實(shí)驗(yàn)在河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[動物使用許可證編號：114007003；SYXK(河南)2016-0008]，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF實(shí)驗(yàn)動物級環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，光照節(jié)律光照∶黑暗=12 h∶12 h、室溫(20±2) ℃、相對濕度50%～60%,安靜狀態(tài)下喂飼SPF級鼠料，自由進(jìn)食飲水。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和哮喘組，每組8只。哮喘組小鼠造模參考本課題組既往造模方法[4]。致敏期：在實(shí)驗(yàn)開始后的第0、7、14天上午10時(shí)分別腹腔注射0.2 mL含25 μg卵清蛋白(OVA)的氫氧化鋁混懸液。激發(fā)期：在實(shí)驗(yàn)開始后的第21～28天內(nèi)，使用20 g/L OVA溶液進(jìn)行霧化激發(fā)，每天上午、下午各1次，每次30 min。對照組小鼠用PBS進(jìn)行處理。末次激發(fā)后24 h進(jìn)行氣道反應(yīng)性測定，氣道反應(yīng)性測定結(jié)束24 h后收集組織標(biāo)本。其中對照組1只小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡。本實(shí)驗(yàn)通過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研和臨床試驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2氣道反應(yīng)性測定采用Buxco無創(chuàng)肺功能儀測定小鼠吸入乙酰甲膽堿(methacholine,Mch)后的增強(qiáng)呼氣間歇(enhanced pause,Penh)。Penh是吸氣峰流速與呼氣峰流速之比標(biāo)準(zhǔn)化之后的值，可反映氣道的反應(yīng)性[5-6]。檢測前依次使用0.000、3.125、6.250、12.500、25.000和50.000 g/L的Mch霧化吸入 2 min，采用Buxco無創(chuàng)肺功能儀收集3 min小鼠的Penh值。

1.3支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)氣道反應(yīng)性檢測24 h后，通過腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，切開頸部皮膚，游離氣管后氣管插管。采用1 mL的注射器抽取0.8 mL的PBS進(jìn)行灌洗，每只小鼠灌洗3次。BALF經(jīng)離心沉淀后取10 μL沉渣涂片，經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定后行瑞士吉姆薩染色，在1 000倍倒置顯微鏡下連續(xù)觀察500個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.4BALF中炎癥因子的ELISA法測定收集BALF離心后的上清，采用ELISA法檢測IL-4、IL-5、IL-13、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)。按試劑盒(聯(lián)科生物)操作說明，將50 μL樣品及標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中，室溫下避光孵育2 h，洗板3次后加入生物素化抗體工作液在室溫下避光孵育1 h。洗板3次后加入100 μL 底物工作液室溫避光孵育30 min，加入100 μL終止液輕輕混勻。在30 min內(nèi)檢測450 nm波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各炎癥因子濃度。

1.5肺組織脂質(zhì)組學(xué)的LC/MS檢測取小鼠左肺置于凍存管中，液氮速凍后暫存于-80 ℃超低溫冰箱。取小鼠肺組織100 mg置于2 mL的離心管中，加入1 mL的甲基叔丁基醚溶液在組織研磨儀中研磨90 s。12 000 r/min離心5 min，取上清液，真空離心濃縮至干，用200 μL 異丙醇復(fù)溶，0.22 μm過濾后上樣。每個(gè)待測樣品取 20 μL混合成質(zhì)量控制樣品后進(jìn)行LC/MS檢測。LC檢測儀器采用Thermo Ultimate 3000，使用ACQUITY UPLC?BEH C18 1.7 μm(2.1 mm×100 mm)色譜柱，自動進(jìn)樣器溫度設(shè)為 8 ℃，以0.3 mL/min的流速、50 ℃的柱溫進(jìn)樣2 μL進(jìn)行梯度洗脫。MS儀器使用Thermo Q Exactive Focus，電噴霧離子源，正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為 3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV。毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率 35 000 進(jìn)行全掃描，并采用高能碰撞誘導(dǎo)解離進(jìn)行二級裂解，碰撞電壓為 30 eV。在獲得定量結(jié)果以后，進(jìn)行脂類內(nèi)部數(shù)據(jù)歸一化得到脂類分子的相對表達(dá)量。

1.6肺組織病理學(xué)檢測取右肺組織，經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，制成石蠟包埋組織后5 μm厚切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后在蒸餾水中浸泡2 min；蘇木精染液染色2 min，經(jīng)分化后置伊紅染液中染色30 s，自來水浸泡2 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后在顯微鏡下拍照分析。Masson染色時(shí)切片用Weigert鐵蘇木精染色液染色5 min，分化10 s后返藍(lán)3 min，水洗后用麗春紅染色5 min；經(jīng)弱酸工作液、磷鉬酸等洗片后置于苯胺藍(lán)染色液中染色1 min；弱酸工作液洗片后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，在顯微鏡下拍照分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間Penh值的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性細(xì)胞計(jì)數(shù)、炎癥因子水平的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);肺組織中脂質(zhì)分子相對表達(dá)量的比較根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布分別采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)[數(shù)據(jù)用中位數(shù)(下、上四分位數(shù))表示]。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠氣道反應(yīng)性比較結(jié)果見表1。隨著Mch濃度的升高，Penh值逐漸升高；且哮喘組小鼠的Penh值高于對照組。

2.2兩組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和炎癥因子水平比較結(jié)果見表2。哮喘組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性細(xì)胞計(jì)數(shù)均較對照組升高；IL-4、IL-5、IL-13、TSLP水平均較對照組升高。

2.3兩組小鼠肺組織脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果共檢測到121種甘油酯類，分別為20種DG、101種TG。與對照組比較，哮喘組小鼠肺組織中有12種甘油酯類表達(dá)升高(表3)。

2.4肺組織病理學(xué)檢測結(jié)果見圖1。HE染色和Masson染色可見，與對照組比較，哮喘組小鼠氣道壁明顯增厚，管腔狹窄，血管周圍及結(jié)締組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管周圍大量膠原沉積。

表1 兩組小鼠Penh值比較

表2 兩組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞和炎癥因子水平比較

表3 兩組小鼠差異表達(dá)的甘油酯類相對表達(dá)量的比較

續(xù)表3

圖1 兩組小鼠肺組織HE和Masson染色結(jié)果

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)OVA誘導(dǎo)的BALB/c哮喘小鼠肺組織中存在明顯的甘油酯類代謝紊亂。脂質(zhì)代謝與哮喘密切相關(guān)。Fenger等[7]通過評估85 555名西班牙工人的喘息、鼻炎癥狀、血脂、血糖、體重指數(shù)等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)高TG和低密度脂蛋白與喘息相關(guān)。Barochia等[8]通過檢測哮喘患者血脂發(fā)現(xiàn)，血清中高密度脂蛋白、載脂蛋白A-I的水平與特應(yīng)性和哮喘患者的FEV1呈正相關(guān)，而FEV1與血清TG、低密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。有學(xué)者[3]通過隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)哮喘兒童與其他全身性炎癥疾病患者一樣存在著血脂代謝紊亂。

本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠存在明顯的甘油酯類代謝紊亂。TG是富含TG的脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins,TGRLs)的主要成分，包括極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)和乳糜微粒，它們分別由肝和腸細(xì)胞合成和分泌。脂蛋白脂肪酶是水解TGRLs中TG主要的酶，TGRLs被水解后釋放游離脂肪酸和甘油單酯，同時(shí)產(chǎn)生乳糜微粒和VLDL。TG參與哮喘的主要作用機(jī)制可能是，一方面VLDL和乳糜微粒可增加內(nèi)皮炎癥和血管內(nèi)皮通透性，最終可能促進(jìn)氣道炎癥滲出[9]；另一方面TGRLs脂肪分解釋放的游離脂肪酸氧化后可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)其凋亡和活性氧簇生成，并改變脂筏的正常功能[10-11]。肥大細(xì)胞在哮喘發(fā)病過程中起重要作用，其在分泌顆粒中貯存大量的炎癥介質(zhì)，包括脂質(zhì)炎癥介質(zhì)，當(dāng)肥大細(xì)胞活化后可通過脫顆粒的形式參與哮喘過程。除了分泌顆粒，肥大細(xì)胞中還存在脂滴，其主要成分是TG。脂滴中的TG在脂肪甘油三酯脂肪酶作用下水解為花生四烯酸，并成為肥大細(xì)胞中花生四烯酸的主要來源，花生四烯酸經(jīng)釋放及代謝后可廣泛參與哮喘過程[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠肺組織中多種TG分子的表達(dá)水平升高。

綜上，采用OVA誘導(dǎo)BALB/c小鼠構(gòu)建哮喘模型可以進(jìn)行甘油酯類代謝與哮喘發(fā)病機(jī)制方面的研究。本研究由于未能進(jìn)行小鼠血漿甘油酯類的LC/MS分析，暫時(shí)不能確定肺組織中差異表達(dá)的甘油酯類能都在血漿中表現(xiàn)出來，因此本研究也具有一定的局限性。