水楊酸柳氮磺胺吡啶對慢性結腸炎小鼠結腸組織中A20蛋白表達及脾臟中Treg比例的影響

趙建波，胡文會，劉志強

1)鄭州大學第二附屬醫院消化內科 鄭州 450014 2)遵義醫科大學珠海校區基礎醫學院生理學教研室 廣東珠海519041 3)深圳市耳鼻咽喉研究所免疫學實驗室 廣東深圳 518172

炎癥性腸病是一種常見的慢性非特異性腸道疾病，其病因尚不十分清楚[1-2]。A20蛋白又稱腫瘤壞死因子誘導蛋白3，是一種泛素修飾酶，在免疫炎癥反應中發揮重要的負性調節作用。A20基因突變與炎癥、自身免疫病、腫瘤發生有關[3]，A20蛋白可能參與了炎癥性腸病的發病過程[4]。調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)是具有免疫抑制特性的一類CD4+T細胞，特異性表達Foxp3轉錄因子，可有效抑制炎癥性腸病的發生[5]。水楊酸柳氮磺胺吡啶作為目前臨床治療慢性結腸炎的主要藥物，其對結腸組織中A20蛋白表達及脾臟中Treg比例的影響仍不清楚。本研究通過建立慢性結腸炎小鼠模型，探討水楊酸柳氮磺胺吡啶灌腸治療對慢性結腸炎小鼠結腸組織A20蛋白表達及脾臟中Treg比例的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑葡聚糖硫酸鈉(DSS，相對分子質量 36 000～50 000)購自美國MP Biochemical公司；水楊酸柳氮磺胺吡啶購自山西同藥集團；兔抗小鼠A20、β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；羊抗兔IgG購自美國 Abcam公司；大鼠抗小鼠CD4、CD25及Foxp3熒光抗體購自美國BD Biosciences公司。

1.2實驗分組、處理及疾病活動指數(DAI)測定18只C57BL/6小鼠 (6～8 周，體重17～22 g)，購自廣東省實驗動物中心，正常供應飼料和飲水。采用隨機數字表法分為對照組、模型組及水楊酸柳氮磺胺吡啶組，每組6只。對照組給予正常飲水；模型組分別在第1、4、7周給予20 g/L的DSS飲水飲用1周；水楊酸柳氮磺胺吡啶組則在模型組基礎上，在第3、4、18、39、46天給予水楊酸柳氮磺胺吡啶0.9 mg灌腸治療[6-7]。小鼠灌腸前12 h禁食，給予乙醚麻醉后，將聚乙烯管插入直腸，深度8 cm，將水楊酸柳氮磺胺吡啶灌入結腸，保持肛門高位5 min。治療后第1～7周末觀察小鼠體重變化，進食、活動及糞便情況，并按照參考文獻[8]方法，將體重下降、糞便性狀和隱血情況評分相加，計算DAI。

1.3結腸組織病理學評分方法第7周末，采取頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出結腸組織，放入40 g/L多聚甲醛中固定12 h，脫水、二甲苯透明、PBS清洗后經石蠟包埋、組織切片后HE染色，光學顯微鏡下觀察炎癥情況。結腸組織病理學評分標準如下[6]。潰瘍：無潰瘍為0分，潰瘍直徑<3 mm 為1分，潰瘍直徑≥3 mm 為2分;炎癥程度：無炎癥為0分，輕度為1分，重度為2分；病變深度：無病變為0分，病變深達黏膜下層為1分，肌層為2分，漿膜層為3分；纖維化：無纖維化為0分，輕度為1分，重度為2分。結果取各項得分之和。

1.4小鼠脾臟Treg比例的測定無菌取各組小鼠脾臟，放入含有小鼠淋巴細胞分離液(深圳達科為生物工程有限公司)的培養皿中，離心分離脾單個核細胞并計數，將細胞密度調整為1×106個/mL，PBS清洗后，冰上加入大鼠抗小鼠 CD4、CD25 及Foxp3 熒光抗體，孵育1 h，上流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T細胞(即Treg)。

1.5小鼠結腸組織中A20蛋白表達的Western blot檢測將小鼠結腸組織剪碎后放入預冷的勻漿器中，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液進行研磨，冰上裂解15 min，離心收集上清，-20 ℃保存備用。根據BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后進行100 g/L SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉至PVDF膜上，BSA封閉1 h，加入A20抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次；加入HRP標記的二抗，室溫振蕩孵育1 h；清洗二抗；采用Pierce ECL化學發光底物試劑盒顯影、定影。以β-actin作為內參，以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6統計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析。不同組間小鼠DAI評分的比較采用重復測量數據的方差分析，結腸組織病理學評分、結腸組織中A20蛋白相對表達量、脾臟組織中Treg比例的比較采用兩獨立樣本的t檢驗或單因素方差分析及LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.13組小鼠的DAI評分對照組小鼠各時間點DAI評分均為0。模型組與水楊酸柳氮磺胺吡啶組DAI評分比較，見表1。

表1 模型組和水楊酸柳氮磺胺吡啶組小鼠DAI評分的比較(n=6)

2.23組小鼠結腸組織病理學評分、結腸組織中A20蛋白相對表達量、脾臟組織中Treg比例的比較對照組小鼠結腸黏膜完整，無炎癥細胞浸潤及潰瘍，黏膜上皮完整，連續性好，結構清晰，黏膜下固有層血管及纖維組織正常；模型組小鼠結腸黏膜出現明顯的糜爛，腺體破壞，黏膜及黏膜下層大量炎性細胞浸潤，固有層局部充血水腫及纖維增生；而水楊酸柳氮磺胺吡啶組小鼠結腸炎癥情況明顯好轉，見圖1。與模型組相比，水楊酸柳氮磺胺吡啶組結腸組織病理學評分降低，結腸組織中A20蛋白相對表達量、脾臟組織中Treg比例升高，見表2。

A：對照組；B：模型組；C：水楊酸柳氮磺胺吡啶組

表2 3組小鼠結腸組織病理學評分、結腸組織中A20蛋白相對表達量、脾臟組織中Treg比例的比較

3 討論

炎癥性腸病是一種常見的慢性非特異性腸道疾病，其關鍵發病機制是易感者針對腸道菌群及食物抗原的異常免疫反應，導致大量的炎性因子在腸道局部聚集，引起炎癥反應[9]。本研究結果顯示,水楊酸柳氮磺胺吡啶灌腸治療可明顯提高慢性結腸炎小鼠結腸組織中A20蛋白表達，并增加小鼠脾臟中Treg比例。

研究[10]顯示，A20基因敲除小鼠對DSS誘導的結腸炎癥反應更加敏感，出現炎癥細胞浸潤、腸道上皮細胞過度凋亡等。A20蛋白過表達則可增強腸道黏膜對脂多糖的耐受性[3]，增強腸道黏膜屏障功能[11-12]。該研究結果顯示，水楊酸柳氮磺胺吡啶作用于結腸黏膜局部，可明顯增加慢性結腸炎時結腸組織中A20蛋白的表達，提示A20蛋白表達變化可能參與了水楊酸柳氮磺胺吡啶的抗炎作用。

研究[6-7]顯示，Th1/Th2細胞比例失衡導致的以Th2細胞占優勢的免疫異常并伴有Treg減少是炎癥性腸病發病的重要原因之一。Treg在維持腸道免疫平衡、抑制過激的免疫反應中具有重要作用[13]。結腸炎患者血液中Treg減少，而腸道黏膜組織中Treg增加，且血液中的Treg數量與DAI評分呈負相關[14-15]。這可能是由于結腸炎癥時Treg被召集到炎癥局部[16-18]。該研究結果顯示，水楊酸柳氮磺胺吡啶干預能夠提高小鼠脾臟中Treg比例，從而對腸道炎癥起到抑制作用。

總之，水楊酸柳氮磺胺吡啶干預能夠明顯提高慢性結腸炎小鼠結腸組織中A20蛋白表達及脾臟中Treg比例。