過(guò)表達(dá)CSRP2對(duì)人B淋巴瘤細(xì)胞Ramos增殖、周期分布、凋亡及CREB表達(dá)的影響

王樹(shù)娟，范 熠，張 雨，李夢(mèng)亞，王 沖，劉 鈺，王偉瓊，郝倩倩，劉延方

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052

半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(cysteine and glycine-rich protein 2，CSRP2)編碼LIM結(jié)構(gòu)域蛋白，參與細(xì)胞發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)過(guò)程[1]。CSRP2與肝細(xì)胞癌去分化有關(guān)[2]；是乳腺癌細(xì)胞偽足肌動(dòng)蛋白束的成分之一，可顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。亦有研究[4]顯示CSRP2是miR-27a的下游靶標(biāo),CSRP2表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)。CSRP2在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究較少，近期研究[5]顯示CSRP2在成人B系急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)中高表達(dá)，可促進(jìn)B-ALL細(xì)胞增殖和周期進(jìn)展，但其機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討CSRP2基因?qū)α馨土鯮amos細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人B淋巴瘤細(xì)胞系Ramos(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，CSRP2過(guò)表達(dá)慢病毒或?qū)φ章《?上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，CCK-8試劑盒(日本Dojin Laboratories公司)，細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗人CSRP2、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、p-CREB、p-Akt、p-ERK、p-mTOR、GAPDH單抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan?Universal PCR Master Mix(美國(guó)ABI公司)，PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、PBS等(北京索萊寶生物科技有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染Ramos細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞密度5×104個(gè)/mL。感染復(fù)數(shù)值為100。加入CSRP2過(guò)表達(dá)慢病毒或?qū)φ章《荆糜谂囵B(yǎng)箱。12 h后將含病毒液的培養(yǎng)基換為普通的完全培養(yǎng)基。病毒感染96 h后，在培養(yǎng)基中加入2.5 mg/L嘌呤霉素，持續(xù)篩選1個(gè)月。將篩選后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株部分凍存，部分?jǐn)U增用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3感染效率檢測(cè)

1.3.1 RT-PCR 分別收集上述2組細(xì)胞約5×106個(gè)，加入1 mL Trizol提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共50個(gè)循環(huán)。以ABL為內(nèi)參，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算CSRP2與ABL的拷貝數(shù)，以(CSRP2/ABL)%作為CSRP2表達(dá)量，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，曲線閾值設(shè)為0.08[5]。CSRP2與ABL引物和探針(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.3.2 Western blot 收集2組細(xì)胞，加上樣緩沖液，加熱變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以50 g/L牛血清白蛋白的TBST室溫封閉1 h，加入一抗(兔抗人CSRP2抗體按1∶500稀釋，GAPDH單抗按1∶1 000稀釋)，24 ℃過(guò)夜，以TBST充分洗膜后，加入二抗，室溫孵育1 h，再次以TBST洗膜后，ECL發(fā)光顯影，用Iquant 350 capture軟件照相并查看結(jié)果。以目的條帶和GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.42組細(xì)胞增殖活性檢測(cè)取2組細(xì)胞分別接種于96孔板，細(xì)胞密度5×104個(gè)/mL，每孔接種100 μL。每組重復(fù)3孔。培養(yǎng)0、2、4、7 d后每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中放置3 h后，應(yīng)用Model 680全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)下的OD值，代表細(xì)胞增殖情況。以無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.52組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)將2組細(xì)胞分別接種于6孔板，細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL，每孔接種2 mL。更換無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,每組重復(fù)3孔。以體積分?jǐn)?shù)75%的冰乙醇固定細(xì)胞，PI染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用ModFit LT 2.0軟件分析細(xì)胞周期分布。根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用Annexin V/PI雙染法染色后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.62組細(xì)胞中CREB、pCREB及其他增殖相關(guān)通路蛋白表達(dá)的檢測(cè)方法同1.3.2,CREB、p-CREB、p-Akt、p-ERK、p-mTOR、GAPDH一抗均按1∶1 000稀釋。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用Graphpad Prism 5.01軟件處理數(shù)據(jù)。采用2×4析因設(shè)計(jì)的方差分析比較兩組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增殖活性，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組CSRP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞周期分布和凋亡細(xì)胞百分比的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1感染效率檢測(cè)過(guò)表達(dá)組CSRP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組升高(圖1、表1)。

圖1 2組細(xì)胞中CSRP2蛋白表達(dá)水平的比較

表1 2組細(xì)胞CSRP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

2.22組細(xì)胞增殖、周期和凋亡情況比較由表2可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度較對(duì)照組快。與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組G1期細(xì)胞減少，而S期和G2期細(xì)胞增多(表3)，提示CSRP2可促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展。過(guò)表達(dá)組凋亡細(xì)胞百分比[(1.630±0.733)%]與對(duì)照組[(1.777±0.634)%]相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.262，P=0.806)。

2.32組細(xì)胞CREB、pCREB及其他增殖相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平的比較與對(duì)照組(0.207±0.093)比較，過(guò)表達(dá)組pCREB表達(dá)水平(0.787±0.237)升高(t=3.954，P=0.017)，而其他增殖相關(guān)通路蛋白p-ERK、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2。

表2 2組細(xì)胞增殖活性的比較

表3 2組細(xì)胞周期分布的比較 %

圖2 2組細(xì)胞不同蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

研究[5]顯示，CSRP2在初診成人B-ALL中廣泛過(guò)表達(dá)，可促進(jìn)B-ALL細(xì)胞增殖、集落形成、細(xì)胞周期進(jìn)展及化療藥物耐藥，但其相關(guān)機(jī)制仍不明確。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明CSRP2過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞Ramos的增殖，與上述研究相符。

細(xì)胞增殖加快可能與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的改變有關(guān)。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明CSRP2可促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，提示CSRP2過(guò)表達(dá)促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞增殖與其促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展有關(guān)，這與既往研究[5]一致。

目前，對(duì)CSRP2相關(guān)信號(hào)通路的研究較少。乳腺癌研究[6]顯示CSRP2可能是缺氧誘導(dǎo)因子-1的直接相互作用蛋白，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲；血管平滑肌細(xì)胞中，TGF-β下游的兩個(gè)信號(hào)通路在CSRP2啟動(dòng)子的CRE和SBE位點(diǎn)匯聚，以協(xié)同控制CSRP2，提示CSRP2是TGF-β下游的重要分子[7]。但以上研究主要針對(duì)上游信號(hào)通路。

本研究發(fā)現(xiàn)CSRP2過(guò)表達(dá)可顯著升高淋巴瘤細(xì)胞中CREB的磷酸化水平，而對(duì)其他增殖相關(guān)通路蛋白如：Akt、ERK、mTOR無(wú)明顯影響。CREB 蛋白是一種亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可被許多絲氨酸-蘇氨酸激酶激活[8]。CREB在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究報(bào)道較多。研究[9-11]顯示，CREB在急性髓系白血病中的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照，且CREB過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后不良，急性髓系白血病細(xì)胞中敲低CREB可顯著抑制細(xì)胞增殖，使S期的細(xì)胞顯著減少，且導(dǎo)致cyclin A1和cyclin D1的下調(diào)。另有研究[12]顯示，CREB在ALL中的表達(dá)水平高于正常對(duì)照，CREB高表達(dá)和CREB磷酸化與成人ALL預(yù)后不良相關(guān)；在ALL細(xì)胞系中敲低CREB可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，CSRP2可能通過(guò)上調(diào)CREB的表達(dá)促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞周期進(jìn)展和增殖，CSRP2及其下游CREB信號(hào)通路有可能成為淋巴瘤新的治療靶標(biāo)。本研究為體外研究，CSRP2在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用、作用機(jī)制及其臨床意義尚需完善動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。