過表達miR-100對急性淋巴細胞白血病細胞增殖、侵襲、遷移及CXCR7/STAT3軸蛋白表達的影響

冶鵬娟，程 振，崔建坡，張文林，羅繼霞，武水如

1)開封市兒童醫院血液科 河南開封 475000 2)開封市中心醫院病理科 河南開封 475000 3)鄭州大學附屬腫瘤醫院血液科 鄭州 450003

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)屬于侵襲性血液系統惡性腫瘤，約占兒童期白血病的75%[1-2]，在成人中也較為常見。其特征是T 系祖細胞異常克隆性增殖，導致白血病淋巴母細胞在骨髓和各種髓外部位積聚[3]，從而引起貧血、發熱、肝脾腫大、關節疼痛以及全身淋巴結腫大等臨床癥狀[4]。在我國，ALL發病率逐年上升，嚴重威脅人們生命健康[5]。隨著現代技術的發展，盡管ALL的標準化療已經取得了顯著性的進展，但是仍有大約30%的患者在骨髓或者中樞神經系統中復發[6]，化療過程中的耐藥以及治療過程中的死亡也仍是ALL治療失敗的重要原因[7]。

microRNA(miRNA)是內源性非編碼小分子RNA，含19～25個核苷酸，在轉錄和轉錄后水平上特異性地調控某些mRNA的表達[8]。目前已有大量研究[9-11]證實miRNA異常表達和腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、轉移以及血管生成有關。有研究[12]表明，miRNA具有調控造血干細胞分化為各類成熟血細胞的能力，不同類型的血細胞中均存在著多種miRNA表達。研究[13]認為miR-126參與白血病干細胞的長期維持和自我更新，其過表達與急性粒細胞白血病患者的不良預后相關。Lv等[14]指出，miR-142-3p通過靶向抑制糖皮質激素受體α的表達，從而促進了ALL的發展。研究[15-17]表明miR-100在胃癌、肺癌、乳腺癌以及骨肉瘤等多種腫瘤細胞和組織中表達異常。本研究探究了miR-100對ALL細胞Nalm6的增殖、侵襲以及遷移的影響，以期為臨床治療ALL提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑Nalm6細胞購自美國菌種保藏中心；胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、RPMI 1640培養液以及Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒與qRT-PCR試劑盒購于美國GeneCopoeia公司；Lipofectamine 2000試劑盒購于美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Costar公司；MTT試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；質粒pmirGLO、雙熒光素酶報告實驗試劑盒均購自Promega公司；鼠抗趨化因子受體7(CXCR7)、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、GAPDH以及HRP山羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2細胞培養及實驗分組將Nalm6細胞用含體積分數10%胎牛血清、青霉素與鏈霉素的RPMI 1640培養液，于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中進行培養，當細胞密度達到80%以上時，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。將對數生長期的Nalm6細胞以每孔2×105個接種至24孔板，分為空白對照組、miR-100 NC組(轉染陰性對照miR-100 NC)及miR-100 mimic組(轉染miR-100 mimic)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉染操作，于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中轉染4～6 h，更換新鮮RPMI 1640培養基繼續培養24 h，收集各組細胞進行后續實驗。

1.3細胞中miR-100表達的檢測使用Trizol試劑提取細胞總RNA，測定提取的RNA純度和濃度。采用cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄獲得cDNA，根據qRT-PCR試劑盒說明書檢測miR-100表達水平，以U6作為內參基因，引物由廣州銳博生物公司合成，序列如下：miR-100上游引物為5’-GCTCTGAACCGTAGATCCGAAC-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，循環40次。采用2-ΔΔCt法計算miR-100的相對表達水平。實驗重復3次。

1.4細胞增殖實驗分別在第1、2、3、4 天每孔加入15 μL MTT(5 g/L)試劑，37 ℃孵育2 h，棄培養液，每孔添加100 μL DMSO，振蕩反應10 min，待細胞中藍紫色結晶甲瓚完全溶解，使用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.5細胞侵襲實驗在Transwell小室的上室加50 μL稀釋的Matrigel膠，于37 ℃培養箱中放置40 min。收集3組細胞，調整細胞密度為1×105個/mL。取各組細胞懸液100 μL，加入Transwell小室的上室，下室加入500 μL含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，置于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中孵育24 h。取出小室，棄培養液，用棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，甲醛中固定20 min，結晶紫染液染色20 min，PBS洗滌兩次后，在電子顯微鏡觀察拍照并計數。實驗重復3次。

1.6細胞劃痕實驗在6孔培養板背面每隔0.5 cm均勻畫一道橫線，每孔中加入Nalm6細胞5×105個，第2天用移液槍槍頭沿直尺垂直于細胞培養孔背后的橫線劃痕，PBS清洗細胞3次，洗去劃痕下的細胞。加無血清RPMI 1640培養液，置37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中繼續培養，于0、24 h取樣，分別觀察劃痕愈合情況并拍照。實驗重復3次。

1.7細胞中CXCR7、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、MMP-2以及MMP-9蛋白表達的檢測采用RIPA裂解液分別提取各組Nalm6細胞的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測提取蛋白的濃度。取30 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入CXCR7、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9以及GAPDH一抗(均按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(按1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗膜， 加入ECL試劑發光顯影，凝膠成像系統中曝光，使用Quantity One軟件分析條帶灰度值。實驗重復3次。

1.8雙熒光素酶報告實驗利用TargetScan生物信息分析軟件預測miR-100與CXCR7基因的結合片段。由廣州銳博生物公司設計并合成野生型CXCR7-WT和突變型CXCR7-MUT的3’-UTR雙熒光素酶報告質粒。將合成的兩種基因片段分別連接到pmirGLO載體上。將對數生長期的Nalm6細胞以每孔1×105個接種至12孔細胞板，使用Lipofectamine 2000將CXCR7-MUT或CXCR7-WT重組質粒聯合miR-100 mimic或miR-100 NC共轉染至Nalm6細胞，在37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養24 h，然后收集細胞，按照雙熒光素酶報告實驗試劑盒說明操作檢測細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.9統計學處理采用SPSS 23.0分析，miR-100 NC組和miR-100 mimic組間熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；各組細胞增殖、侵襲和遷移情況，以及CXCR7、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1miR-100轉染效果觀察轉染24 h后，空白對照組、miR-100 NC組及miR-100 mimic組Nalm6細胞中miR-100的表達水平分別為(1.00±0.11)、(1.08±0.06)和(4.19±0.62)，3組間相比，差異有統計學意義(F=573.832，P<0.001)；與空白對照組和miR-100 NC組比較，miR-100 mimic組細胞中miR-100表達水平顯著升高(P<0.05)。

2.2各組Nalm6細胞增殖實驗A值比較轉染后第2、3、4 天，miR-100 mimic組Nalm6細胞增殖能力顯著低于空白對照組和miR-100 NC組，見表1。

表1 各組Nalm6細胞增殖實驗A值比較(n=3)

2.3各組Nalm6細胞侵襲和遷移細胞數比較與 空白對照組和miR-100 NC組相比，miR-100 mimic組Nalm6細胞的侵襲與遷移能力均顯著降低，見表2。

表2 各組Nalm6細胞侵襲和遷移細胞數比較(n=3)

2.4各組Nalm6細胞CXCR7、p-STAT3、Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達與空白對照組和miR-100 NC組相比，miR-100 mimic組Nalm6細胞中CXCR7、p-STAT3、Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著下降，見圖1和表3。

2.5miR-100與CXCR7的靶向關系TargetScan軟件分析預測到miR-100與CXCR7 3’UTR區存在結合片段，見圖2。熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-100 mimic+CXCR7-WT共轉染組熒光強度較miR-100 NC+CXCR7-WT共轉染組降低，而miR-100 mimic+CXCR7-MUT共轉染組與 miR-100 NC+CXCR7-MUT組熒光強度差異無統計學意義，見表4。

1：空白對照組；2：miR-100 NC組；3：miR-100 mimic組

表3 各組Nalm6細胞CXCR7、p-STAT3、Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(n=3)

圖2 miR-100與CXCR7的3’UTR互補結合位點

表4 各組熒光素酶活性比較(n=3)

3 討論

ALL是最為常見的白血病類型，盡管近幾年ALL化療取得了令人矚目的成就，但復發后的多藥耐藥性仍是臨床治療失敗的主要原因[7]。探尋與ALL相關的標志物對于臨床治療與預后分析均有重要的意義。

miRNA與腫瘤的發生密切相關。miRNA的靶向分子治療作為惡性腫瘤治療的一個新方向越來越被研究者們所重視[18]。miR-100是miR-99家族中的一員，有文獻[19]報道，針對腫瘤類型和微環境的不同，miR-100發揮不同作用，其功能及作用機制受到研究者廣泛關注。miR-100在乳腺癌、肝癌、宮頸癌、骨肉瘤以及肺癌等多種腫瘤中呈現低表達[17,20-21]。研究[22]發現miR-100在兒童ALL中呈低表達。本研究結果顯示，Nalm6細胞轉染miR-100 mimic后，細胞增殖、侵襲及遷移能力均被抑制，提示miR-100可阻礙Nalm6細胞的生物學惡性行為。Cyclin D1通過CDK4和CDK6的特異性結合來催化Rb蛋白磷酸化，使細胞從G1期轉入S期，導致細胞異常分裂[23]。MMPs是一類鋅離子依賴性蛋白水解酶，可以通過裂解細胞因子、趨化因子和生長因子來調節機體生理和病理過程，參與細胞外基質的重塑和降解[24]。MMP-2和MMP-9在腫瘤細胞中的表達水平較高，并且與不良預后呈正相關[25]。本研究結果顯示，Nalm6細胞轉染miR-100 mimic后，Cyclin D1、MMP-2與MMP-9表達水平均明顯降低，表明miR-100可通過調控Nalm6細胞中與增殖、遷移相關的蛋白水平，從而抑制腫瘤細胞的生物學活性。

CXCR7是G蛋白偶聯受體家族的成員，作為一種常見的趨化因子受體其在許多癌癥中呈高表達[26]。已有報道[27]指出，CXCL12/CXCR7在急性髓細胞性白血病和慢性粒細胞性白血病中均發揮重要作用。Li等[28]證明CXCR7通過激活STAT3信號傳導途徑，促進乳腺癌細胞的增殖和轉移。而STAT3通常也在許多類型的白血病中過表達，STAT3激活與急性T淋巴細胞白血病細胞的增殖、凋亡、細胞周期以及侵襲等有著密切聯系[29]。本研究結果表明CXCR7是miR-100的靶標基因，而Nalm6細胞轉染miR-100 mimic后抑制了CXCR7和STAT3蛋白的表達，說明miR-100可能是通過抑制CXCR7/STAT3信號通路的激活來調控腫瘤細胞的生物學活性。

綜上所述，過表達miR-100可抑制ALL細胞的增殖、侵襲與遷移，這可能與CXCR7/STAT3信號通路的激活受到抑制有關。