蟲草素對脂多糖處理的鼻黏膜上皮細胞增殖和細胞因子表達的影響

姚香萍,彭紅星,吳金如

1)湖北文理學院附屬醫院(襄陽市中心醫院)呼吸內科 湖北襄陽 441000 2)華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院呼吸與危重癥醫學科 武漢 430000

呼吸道內表面的黏液層是人體抵御外來有害物質入侵的第一道防線，起著保護和潤滑、維持內環境穩態、抵御外來入侵等作用。但黏液分泌過量會打破內環境穩態，引起鼻-鼻竇炎、變應性鼻炎、鼻息肉等疾病，嚴重影響患者生活質量[1-2]。蟲草素又稱蟲草菌素，是我國名貴中藥材冬蟲夏草的主要活性成分，具有抗腫瘤、促進細胞凋亡、抗細胞增殖、抗炎等廣泛作用[3]。蟲草素通過抑制NO合酶和COX-2基因的表達拮抗NO的生成，還可通過抑制NF-κB的活性以及AKT和P38的磷酸化實現抗炎作用[4-5]。本實驗分離培養人鼻黏膜上皮細胞，用脂多糖(LPS)誘導鼻黏膜上皮細胞產生炎癥反應，探討蟲草素對LPS處理的鼻黏膜上皮細胞增殖及細胞因子表達的影響，為治療黏液蛋白高分泌引起的疾病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1標本來源與主要試劑2019年10月至12月本院耳鼻咽喉科做鼻腔血管電凝術的患者18例，經過患者和家屬同意，取下鼻甲黏膜。患者無全身及鼻腔局部炎癥、無變應性疾病，取材前兩個月未使用激素類藥物。Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶購于美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM/F12培養基購于美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購于浙江金力制藥有限公司；Trizol試劑盒、M-MLV反轉錄試劑盒購于美國Promega公司；SYBR Green Gene Expression Assay購于大連寶生物有限公司；實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成；p-IκBα抗體、p-P65抗體購于美國Abcam公司；FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體購于北京全式金公司。

1.2鼻黏膜上皮細胞的分離培養無菌條件下，將鼻黏膜標本用含100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素雙抗的生理鹽水反復浸泡、清洗，清除表面血液及黏液，將組織剪成約1 mm3的小塊。加入5倍體積的1 g/L的膠原酶，37 ℃孵育60 min，用濾網(200目)過濾，4 ℃條件下1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入體積分數15%胎牛血清的DMEM/F12培養液(含雙抗)重懸細胞，37 ℃培養1 h，去除成纖維細胞。收集懸浮細胞，種植于96孔板，置于37 ℃、飽和濕度細胞培養箱中培養。24 h后更換成含生長因子的培養液，隔天換液，用不含血清培養液培養7 d左右，細胞匯合度達到80%時傳代，傳代后的細胞進行后續實驗。

1.3細胞分組將生長狀態良好的鼻黏膜上皮細胞分別用0、1、2、4、8 mg/L的蟲草素作用24 h(根據預實驗結果篩選的處理時間)后，采用MTT法檢測細胞增殖活性。對鼻黏膜上皮細胞進行分組，不處理的細胞為對照組，100 mg/L LPS(濃度選擇參考文獻[6])處理48 h的細胞為LPS組，100 mg/L LPS處理48 h后加入4 mg/L蟲草素處理24 h的為LPS+蟲草素組。

1.4MTT法檢測鼻黏膜上皮細胞增殖情況取各組鼻黏膜上皮細胞，棄培養基后加入0.5 mg/L的MTT，37 ℃繼續培養4 h。棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，緩慢振蕩10 min，待結晶物充分溶解后，酶標儀測定570 nm波長處的吸光度(A)值。細胞相對存活率=實驗組A值/對照組A值。實驗重復3次。

1.5qRT-PCR檢測細胞中IL-1β、TNF-α、ICAM-1mRNA的表達取各組鼻黏膜上皮細胞，按照Trizol說明書提取細胞總RNA。用M-MLV反轉錄試劑盒配置反轉錄反應體系合成cDNA，依次加入5 μg總RNA，Oligo(dT)2 μL，加RNase-free H2O至14.5 μL，70 ℃孵育5 min，離心后依次加入4 μL 5×M-MLV Buffer，1 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.5 μL RNase Inhibitor，1 μL M-MLV，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，95 ℃加熱5 min，取適量反應產物用SYBR Green Gene Expression Assay進行PCR，反應體系為20 μL。引物序列如下：TNF-α 上游5’-AT GAGCACAGAAAGCATGATG-3’，下游 5’-TACAG GCTTGTCACTCGAATT-3’；IL-1β 上游5’-AAGCT GTGGCAGCTACCTATGTCT-3’，下游 5’-CTCTGCT TGAGAGGTGCTGATGTAC-3’；ICAM-1 上游 5’-GGCGTCCATTTACACACTATTA-3’，下游:5’-TTC CTTTTCTTCTCTTGCTTG-3’。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA的表達水平。實驗重復3次。

1.6Western blot檢測細胞中p-IκBα、p-P65蛋白的表達取各組鼻黏膜上皮細胞，每孔加入PMSF裂解液150 μL，置冰上孵育20 min。收集細胞，12 000 r/min離心10 min。BCA法進行蛋白定量測定。加40 μg蛋白樣品至加樣孔中，進行SDS-PAGE電泳，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。用50 g/L牛血清白蛋白4 ℃封閉過夜，加入p-IκBα、p-P65一抗(按照1∶1 000稀釋)后在搖床上室溫反應2 h，4 ℃過夜，用TBS洗滌3次后加入二抗，室溫中避光孵育2 h。用TBS洗滌后進行化學發光，以GAPDH為內參，以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.7統計學處理應用SPSS 21.0分析，不同濃度蟲草素作用后鼻黏膜上皮細胞的相對存活率，各組細胞A值，IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA表達水平，p-IκBα、p-P65蛋白表達水平的比較均采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1蟲草素對鼻黏膜上皮細胞的最佳作用劑量蟲草素作用鼻黏膜上皮細胞24 h后，細胞相對存活率結果見表1。4 mg/L蟲草素對鼻黏膜細胞促進作用最明顯，設為最佳作用濃度。

表1 不同濃度蟲草素作用24 h后鼻黏膜上皮細胞的相對存活率

2.2各組鼻黏膜上皮細胞A值的比較結果見表2。與對照組相比，LPS組細胞增殖能力明顯降低，LPS+蟲草素組細胞增殖能力升高。

表2 各組鼻黏膜上皮細胞A值比較

2.3各組鼻黏膜上皮細胞中IL-1β、TNF-α、ICAM-1mRNA的表達結果見表3。LPS處理可誘導鼻黏膜上皮細胞的細胞因子的表達，產生炎癥反應；蟲草素能夠抑制LPS誘導的細胞因子的分泌。

2.4各組鼻黏膜上皮細胞中p-IκBα、p-P65蛋白的表達結果見表4。蟲草素可以降低LPS誘導的鼻黏膜上皮細胞中p-IκBα、p-P65蛋白的表達。

表3 各組細胞中IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA表達水平的比較

表4 各組鼻黏膜上皮細胞中p-IκBα、p-P65蛋白表達水平的比較

3 討論

鼻部炎癥性疾病多由鼻黏膜細胞分泌的黏液過多引起，患者多表現為頭痛、頭暈等癥狀，嚴重影響生活及工作。在正常生理狀態下，黏蛋白基因穩定表達，在病理狀態下，黏蛋白基因表達上調，很多致炎因子均可促進黏蛋白基因的表達[7]。體外分離培養人鼻黏膜上皮細胞，利用IL-1β處理24 h后，細胞中MUC2 和MUC5B mRNA的表達水平均升高，說明IL-1β是一種有效的體外黏蛋白刺激因子[8]。本研究結果顯示，LPS處理鼻黏膜上皮細胞后，細胞增殖活性降低，細胞因子IL-1β、TNF-α和I CAM-1 mRNA表達增多，說明LPS可以抑制鼻黏膜上皮細胞增殖，誘導細胞因子分泌，引起鼻黏膜上皮細胞炎癥反應。

蟲草素通過影響免疫器官、免疫細胞、細胞因子和單核巨噬細胞系統發揮調節免疫、抗炎等功能[9-11]。研究[12]顯示，蟲草素能夠提高氣道上皮9HTZ細胞增殖活性，降低細胞因子1L-6、1L-1β的分泌，對9HTZ細胞起到保護作用。相關研究[13]指出，蟲草素通過下調NF-κB的活性發揮抗炎作用，蟲草素處理LPS刺激的體外培養的小鼠巨噬細胞后，炎癥因子TNF-α、1L-6、1L-12的含量明顯減少， 說明蟲草素在一定程度上能夠抑制細胞因子的分泌；此外，細胞核中P65含量減少，說明蟲草素通過抑制NF-κB信號通路來下調細胞因子的表達，最終調控炎癥反應。NF-κB是一類核轉錄因子，參與細胞生長和細胞炎癥反應等過程。當細胞處于靜息狀態時，NF-κB與抑制蛋白IκB結合，當細胞受到刺激時，抑制蛋白IκB磷酸化成p-IκB，與IκB結合的核轉錄因子NF-κB解離，誘導促炎因子、IL、TNF等的表達，促使炎癥發生[14-15]。本研究結果顯示，蟲草素能夠促進鼻黏膜上皮細胞增殖；蟲草素處理后，LPS誘導的鼻黏膜上皮細胞中IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA和p-IκBα、p-P65蛋白表達量顯著下降，提示蟲草素可能通過抑制NF-κB信號通路，抑制細胞因子的表達，實現抗炎作用。

總之，蟲草素通過抑制NF-κB信號通路中蛋白p-IκBα、p-P65的表達和細胞因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1的分泌發揮鼻黏膜上皮細胞的抗炎作用。