降低飼料和飼料原料中霉菌毒素技術的研究進展

馮 利，王 兵，趙 歡，薛士科

（河北工業職業技術學院，河北石家莊 050091）

1 前言

真菌毒素是由各種真菌產生的次生代謝物，主要屬于曲霉菌、鐮刀菌或青霉菌。有證據表明，這些代謝物可能作為毒力因子，增加真菌的生存能力，增加植物致病性，抑制細菌競爭，或作為真菌物種間的化學信號。這些霉菌毒素在農業上造成了嚴重問題（Audenaert等，2014）。谷物、水果和油籽作物的霉菌毒素污染在全球范圍內已造成數十億美元的損失。在美國，由3種主要真菌毒素（黃曲霉毒素B1、伏馬毒素和嘔吐毒素）造成的平均經濟損失每年估計為2.43億美元。在動物健康方面，霉菌中毒可引起的不良反應從慢性黃曲霉毒素攝入引起的肝癌到暴露于玉米赤霉烯酮引起哺乳動物的高雌激素血癥（Wu等，2014）。豬由于對嘔吐毒素的高敏感性，其中毒特點是腸胃炎和免疫毒性，而赭曲霉毒素A是誘發腎病和慢性食道癌的危險因素（Wu等，2014）。由于真菌對動物健康的廣泛影響，我們很容易理解為什么大多數國家都制定了飼料和原料中毒素的限量標準。目前對抗霉菌毒素的方法大致可分為兩類：收獲前控制毒素生產和收獲后對受污染商品的脫毒或解毒。雖然已經發表了一些關于飼料中霉菌毒素控制的綜述，但這些綜述通常基于理論，很少有商業應用的產品（He等，2010）。由于專利技術具有很高的商業化和未被工業利用的可能性，本文綜述了近年來在專利出版物中報道的降低飼料中霉菌毒素的最新技術。

2 真菌毒素的脫毒和解毒措施

2.1 物理方法

2.1.1 作物收獲后加工的物理脫毒 物理方法有快速干燥，紫外線處理和浸泡等，其目的是減輕收獲后的真菌毒素。Miljkovic等（2010）報道，快速干燥（100～180℉，6～48 h）能將含水量降到20%以下，間接減少了全珠咖啡櫻桃霉菌毒素水平。Newman（2009）報道了中長波長紫外線A和紫外線B對固體食品中的解毒作用，如在2000 lB/h杏仁的高產量下，幾乎100%的黃曲霉毒素在60 s內被去除，這種方法在不影響感官特性的情況下，使食品保持在天然狀態，同時提高市場價值。另一種物理分離技術稱為浸泡技術，利用受污染谷物和未受污染谷物之間的特定重量差異，通過浸泡去除部分霉菌毒素（Bethke等，2014）。

2.1.2 物理吸附 在畜禽飼料中添加吸附劑的目的是通過阻止真菌毒素通過黏附劑和真菌毒素之間的復雜結構進入動物血液和器官，從而減輕真菌毒素的有害影響。在過去的幾十年里，人們研究了各種不同來源的黏合劑對真菌毒素的吸附效果。第一代粘結劑，即所謂的礦物吸附劑或無機吸附劑，主要是粘土礦物群中的硅酸鹽，其中最重要的是蒙脫石、水合鋁硅酸鈉，特別是膨潤土或蒙脫石。礦物吸附劑的結合效能與結合劑和真菌毒素的結構有關，吸附劑的電荷分布、表面積、孔徑及真菌毒素的電荷分布、極性和形狀對整體結合相容性有顯著影響（Kabak等，2006）。雖然許多現有的礦物吸附劑能有效隔離黃曲霉毒素，但體內研究發現，它們似乎不能有效地結合其他非黃曲霉毒素，尤其是三聚氰胺。礦物吸附劑具有一定的局限性，包括對維生素、氨基酸和礦物質的吸附，以及絡合化學物質對礦物吸附劑的潛在風險。為了克服這些缺點，第二代吸附劑已從微生物的細胞壁成分中開發出來，主要候選微生物包括酵母、乳酸菌和曲霉分生孢子。解毒的機制仍然是物理吸附，由滅活的細胞壁促進，而不是由活的微生物分解代謝真菌毒素，這些細胞壁的多糖、蛋白質和脂質成分通過氫鍵、離子和疏水相互作用為真菌毒素的附著提供了許多潛在的位點（Ringot等，2007）。如從濕酒糟、干酒糟及其可溶物中獲得的酵母生物質，具有結合各種霉菌毒素的能力，其中酵母細胞壁的β-葡聚糖能有效結合玉米赤霉烯酮毒素（Yiannikouris等，2014）。酵母細胞壁與礦物粘土的結合顯著增強與真菌毒素的結合能力，在體外研究中，其組合協同作用增強了對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素的解毒作用，但對嘔吐毒素、赭曲霉毒素和T2毒素的吸附能力較低。

2.2 化學方法 化學解毒技術涉及使用堿、酸、氧化劑、醛或亞硫酸氫鹽來改變真菌毒素的結構或生物利用度。公眾對動物飼料和人類食品中潛在有害化學物質日益關注，引導了利用農產品中無害和固有成分脫毒新方法的發展。如甘油被美國食品及藥物管理局歸類為通用食品添加劑，它在消化系統中無毒，在單胃動物的日糧中是一種有用的能量來源。Venter（2004）報道了一種解毒方法，包括甘油和氫氧化鈣混合產生的增強性復合物，甘油由于羥基離子的積聚而增強，具有強大的解毒作用。

2.3 生物方法 以生物為基礎的解毒方法被認為是高效、特異、環保的。在不涉及有害化學物質的情況下，營養和感官特征（如顏色和味道）被輕微改變或完全不改變。篩選和分離天然存在的微生物來轉化霉菌毒素已成為一種流行的策略。另一種可能的做法是直接應用具有商業價值的生物活性材料，如酶、多肽等。

2.3.1 微生物的脫毒作用 良好的真菌毒素生物控制候選微生物通常來自于一個特定的環境。這些細菌與污染的真菌毒素共存，對參與真菌毒素耐受或耐藥的代謝途徑保持選擇壓力，進一步使這些化合物有可能被用作碳源。如在最近的一項專利申請中，通過飼料接觸霉菌毒素的雞大腸內容物表現出高度的生物轉化活性，將嘔吐毒素轉化為毒性較低的衍生物。該菌株180507-1被保存在加拿大國際保藏局，通過16S rRNA序列比對，鑒定為與桿菌序列相似度96%的革蘭氏陽性菌（Zhou等，2014）。除了腸道，富含作物碎屑的表層土壤也被證明是生物轉化微生物的良好儲藏地。IDAC 040408-1標記下的一株微生物是通過篩選來自加拿大的165種農業土壤獲得的，這些土壤以前種植過玉米、小麥、大麥、苜蓿、大豆、豌豆、土豆、三葉草、南瓜、煙草、人參、蘋果或油菜作物。與IDAC 180507-1菌株不同，IDAC 040408-1可以通過外膜化反應將嘔吐毒素轉化為主要產物3-嘔吐毒素，也可以轉化為2個次要產物，包括3-酮-嘔吐毒素和1個未知化合物（Zhou和He，2012）。聚合酶鏈反應擴增和末端限制長度多態性等分子技術有可能降低細菌培養的復雜性。

另一種分離具有理想的霉菌毒素生物轉化能力的微生物的方法是檢測以前確定的菌株。這些被選擇的菌株也有能力減少其他真菌毒素，如玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1等。了解分離微生物的解毒生理學可以增加飼料產品的商業應用。但需要考慮的重要參數包括影響菌株生長和解毒活性的外部因素，如pH、溫度、需氧量、培養基和孵育時間、生物轉化活性的穩定性和效率以及解毒代謝物的安全性。如嘔吐毒素解毒細菌IDAC 180507-1（未知的芽孢桿菌株）可以在4～10的pH范圍內生長（最佳pH為6～8），溫度范圍為15～55℃（最佳溫度為37～42℃）（Zhou等，2014）。在最佳溫度和好氧培養環境下，72h內，該菌株在玉米粉緩沖液培養基中顯示出顯著的細胞生長和嘔吐毒素向3-嘔吐毒素的生物轉化（Zhou和He，2012）。Schatzmayr等（2012）報道了伏馬毒素解毒菌株具有快速解毒和在復雜介質中保持生物轉化能力的優點。菌株DSM 16254和DSM 16257在有氧條件下，25℃孵育1 h后，伏馬毒素（2 mg/L）的解毒率為100%。在相同條件下培養5 h后，菌株DSM 16254對濃度為2～500 mg/L的伏馬毒素具有降解能力。當使用復合培養基時，盡管培養時間延長至72 h，菌株在初始伏馬毒素濃度為10和100 mg/L時仍表現出100%的解毒能力。

2.3.2 分解代謝酶的作用 正如前面幾節指出的，在過去30年中，許多消除真菌毒素相關副作用的生物學方法被廣泛使用，但最終目標是分離出能生物降解這些污染物的高效酶。酶是很有吸引力的目標，因為它們可以以一種高度專一和高效的方式加速化學反應。近年來，隨著重組DNA技術和蛋白質工程的發展，酶已成為重要的催化載體，可廣泛應用于不同的工業領域。微生物酶因其穩定性好、易于生產和修飾、產量高和經濟可行而受人們的青睞。

在過去的二十年中，探索和鑒定真菌毒素降解菌的基因/蛋白質組構成已成為一種非常有吸引力的方法，可以用來鑒定參與生物轉化的新型酶/基因，特別是在下一代測序技術、活性篩選和分子克隆技術取得進展的情況下，探索真菌毒素降解酶的興趣似乎呈指數級增長。盡管在工業應用中分離支原體降解酶的公共利益日益增長，但實際識別酶/基因的數量仍然滯后。最近報道了一種黃曲霉毒素解毒酶（Yao等，2010），該酶是由腹腔巨噬細胞蜜環菌總RNA制備而成的，該酶的等電點為5.～-6.8，分子質量為73～77 kDa，含有695個氨基酸。重組解毒酶能解毒黃曲霉毒素B1，顯著降低該毒素的誘變作用。玉米赤霉烯酮可以被漆酶降解，漆酶是一種含銅氧化酶，在工業上廣泛應用，因此，在這方面具有很大的潛力。在植物應用方面，Karlovsky等（2004）報道了一種新的用于玉米淀粉解毒的多肽，它可以與一種外源啟動子融合，產生一種穩定轉化的轉基因植物。如前所述，已鑒定的酶的數量仍然有限。解毒酶的分離成功率低的原因似乎與這一過程的復雜性有關。

3 研究展望

人們對綠色技術的接受程度越來越高，在這種背景下進行技術投資在經濟上是可行的，在科學上也有回報。酶工程技術可以增強活性，或改變特異性或穩定性。酶的定向進化具有無可比擬的潛力，以改進最初的設計和產生具有最高加工特性的生物催化劑（耐極端溫度、pH等），這些工具的效率只會不斷提高。最后，加強政府機構之間的合作，大學和私營生物技術公司之間的合作，加快新的生物脫毒劑（微生物和酶）的鑒定和批準過程。