ISSR分子標記技術在作物遺傳育種中的應用

牛姣姣

ISSR分子標記技術在作物遺傳育種中的應用

牛姣姣

（新鄉學院河南新鄉453003）

作物遺傳育種是專門研究農作物遺傳改良的理論、方法與技術的科學；搞好作物遺傳育種，可以為農業生產培育優良的作物品種。而ISSR分子標記技術則是一項重要的分子標記技術，該技術具有較高的穩定性與多態性，成本低廉，可以廣泛應用于不同生物基因組多態性分析中。文章結合實例，闡述了ISSR技術在作物遺傳育種中的應用。

ISSR分子標記技術；作物；遺傳育種；應用

農作物同其他任何生物一樣，在繁殖后代的過程中，其子代與親代之間，可以保持著相似的性狀。但在農作物長期世代相傳的繁衍過程中，其性狀也可能發生明顯的變異[1]。——作物遺傳育種，正是通過研究農作物遺傳、變異的規律，根據國民經濟與農業生產發展的需要，有意識地培育新的農作物品種。搞好作物遺傳育種，可以為農業生產培育優良的作物品種，從而促進我國農業長期可持續發展。

搞好作物遺傳育種，首先需要研究并掌握農作物遺傳、變化的規律。研究農作物遺傳、變化規律，又需要運用分子標記技術。而ISSR分子標記技術，則是具有極高實用價值的分子標記技術。

1 ISSR分子標記技術

生物子代個體間的遺傳物質內核苷酸序列一旦發生變異，便會留下明顯的遺傳標記（生物子代個體基因組中具有明顯差異性的某個DNA片段），這種標記稱為DNA分子標記[2]。分子標記均勻分布于生物子代個體的整個基因組內，一旦摸清分子標記，便可掌握生物遺傳變異的基本規律。因此，主要發達國家的分子生物學專家們自20世紀70年代以來一直在積極研究分子標記技術，并陸續研發出十多種分子標記技術。

1994年，加拿大蒙特利爾大學研發出ISSR分子標記技術（InterSimpleSequenceRepeat）。ISSR技術的基本原理是：在真核生物基因組中，每隔一定區段便有一個簡單序列重復的SSR序列（也稱微衛星DNA）。SSR序列由1～6個核苷酸為重復單位組成，具有多態性位點多、信息含量豐富、分布廣泛等特點。因此，可以設計出與SSR序列相結合的PCR引物（一對可以擴增SSR序列的合適的核苷酸片段），然后，在PCR引物的3'端或5'端接上2～4個嘧啶堿基或嘌呤，對2個相距較近，方向相反的重復序列之間的DNA片段進行擴增。——如果基因組在這些擴增區域內發生DNA片段插入、缺失或堿基突變以及其他結構變異，就可能導致這些區域與引物結合的數量和位置發生改變，從而使PCR擴增片段數量及長度發生改變。通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，就可檢測出基因組在這些SSR座位的多態性[3]。

由于ISSR屬于顯性標記，因此，ISSR技術具有較高的穩定性與多態性，可以為研究對象快速構建基因組指紋圖，可以同時檢測基因組多個SSR座位，可以揭示出不同生物基因組中各種簡單重復序列的組成、變化頻率；采用ISSR技術，DNA用量少，成本較低，技術要求低，因此，ISSR技術在作物遺傳育種中可以大顯身手。

2 在作物遺傳育種中應用ISSR分子標記技術

在過去，人們只能憑經驗進行作物遺傳育種；不僅需要耗費大量時間，而且育種的成功概率也非常低。在作物遺傳育種中應用ISSR分子標記技術，可以迅速查清作物的基因組序列，為作物構建基因組圖譜，調查作物之間的遺傳相似系數，從而提高作物遺傳育種的成功率[4]。下面，我們將結合某農業大學馬鈴薯雜交育種試驗的實例，闡述如何在作物遺傳育種中應用ISSR分子標記技術。

2017年，北方某農業大學的專家們選擇內蒙古一家試驗農場進行了一次馬鈴薯雜交育種試驗。選用的馬鈴薯母本為“JO7-2”“J07-4”“JO7-6”（均為日本馬鈴薯品種），選用的馬鈴薯父本為“隴薯6號”“隴薯7號”。專家們將“隴薯7號”與“JO7-2”進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子A；將“隴薯6號”與“J07 -4”進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子B；將“隴薯6號”與“JO7-6” 進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子C；將“隴薯7號”與“JO7-6”進行人工雜交，獲得雜交馬鈴薯種子D。

專家通過剪取馬鈴薯的嫩葉，提取了該次雜交育種試驗5個父本、母本馬鈴薯的基因組DNA，然后選擇5種ISSR引物，采用電泳檢測，對這5種馬鈴薯進行了ISSR分子鑒定。

5種ISSR引物分別為：

（1）AF 18550，序列為5’-CTCTCTCTCTCTCTCTAC-3’。

（2）AW20617，序列為5’-AGCAGCAGCAGCAY-3’。

（3）AW75511，序列為5’-ACACACACACACACACY G-3’。

（4）AW20607，序列為5’-AGAGAGAGAGAGAGAGY T-3’。

（5）AF18549，序列為5’-AGAGAGAGAGAGAGAGC T-3’。

而后，專家又提取了4個雜交馬鈴薯種子的基因組DNA，對它們也進行了ISSR分子鑒定。結果發現：

雜交馬鈴薯種子A的基因組DNA中，擴增出2條父本特征帶，5條父母本共有帶，2條新增條帶（新增帶條與父本特征帶、母本特征帶相比存在明顯差異）。

雜交馬鈴薯種子B的基因組DNA中，擴增出2條父母本共有帶，1條父本特征帶，1條母本特征帶。

雜交馬鈴薯種子C的基因組DNA中，擴增出2條父母本共有帶，5條父本特征帶。

雜交馬鈴薯種子D的基因組DNA中，擴增出3條父母本共有帶、2條父本特征帶、1條新增條帶（新增帶條與父母本帶相比存在明顯差異）。

馬鈴薯屬于自花授粉植物，通過人工授粉進行雜交育種，很容易產生偽雜種。因此，必須采用形態學或細胞學方法鑒定雜種的真實性。但形態學標志鑒定方法（主要研究植物體的質量性狀與外部形態特征）、細胞學標志鑒定方法（主要研究植物體內染色體核型與染色體帶型）需要耗費大量的時間，而且反映的遺傳信息量也比較少[5]。采用ISSR分子標記技術，則克服了形態學鑒定方法與細胞學鑒定方法的缺陷。

在此次馬鈴薯雜種鑒定中，專家們進行了ISSR分子鑒定，快速提取了馬鈴薯雜交種子的大量遺傳信息，在短時間內證實了雜種的真實性[6]。

其后，專家將雜交馬鈴薯種子A、B、C、D進行了栽培實驗，從播種至馬鈴薯塊莖成熟，前后歷時100多天。實驗結束后，專家們又仔細測量了馬鈴薯主莖第一花序分支處至地表的高度（株高），芽眼深度（芽眼深度低于1 mm為“淺”，芽眼深度在1～2 mm之間為“較淺”，芽眼深度在2～3 mm之間為“較深”，芽眼深度超過3 mm為“深”），計算了每一根單株結出的馬鈴薯塊莖數量，最后還分析、測量了馬鈴薯內的干物質含量、淀粉含量、還原糖含量與維生素含量。結果如下。

雜交馬鈴薯種子A：生育期為128 d，株高在83.4～95.8 cm之間，芽眼深度較淺，單株產量在0.45 ～1.23 kg之間，單株結薯數在7～11 個之間，干物質含量在18.91 %～23.85 %之間，淀粉含量在14.30 %～18.22 %之間，還原糖含量在0.028 %～0.053 %之間，維生素C含量在16.65 ～36.44 mg/100 g之間。

雜交馬鈴薯種子B：生育期為128 d，株高在56.5～82.5 cm之間，芽眼深度較深，單株產量在0.33～0.81 kg之間，單株結薯數在4～7個之間，干物質含量在17.22 %～21.44 %之間，淀粉含量在13.01 %～16.94 %之間，還原糖含量在0.031 %～0.084 %之間，維生素C含量在14.70 ～15.22 mg/100 g之間。

雜交馬鈴薯種子C：生育期為135 d，株高在73.3～104.7 cm之間，芽眼深度較深，單株產量在0.54 ～0.99 kg之間，單株結薯數在6～12個之間，干物質含量在16.20 %～19.88 %之間，淀粉含量在11.43 %～14.71 %之間，還原糖含量在0.055 %～0.127 %之間，維生素C含量在7.83 ～15.44 mg/100 g之間。

雜交馬鈴薯種子D：生育期為128 d，株高在86.1～107.7 cm之間，芽眼深度較深，單株產量在0.66 ～1.17 kg之間，單株結薯數在4～14個之間，干物質含量在21.75 %～25.33 %之間，淀粉含量在17.18 %～18.21 %之間，還原糖含量在0.077 %～0.121 %之間，維生素C含量在7.85 ～27.45 mg/100 g之間。

此次栽培實驗取得了圓滿的成功，這充分說明在馬鈴薯育種中ISSR分子標記技術可以發揮很大的作用。

3 小結

作物遺傳育種是一項重要的農業科研工作。搞好作物遺傳育種，有助于保障我國糧食安全，促進我國農業長期可持續發展。——ISSR分子標記技術具有較高的穩定性與多態性，可以在短時間內構建作物的基因指紋圖譜。為提升作物遺傳育種的成功率，縮短育種時間，我們應當積極應用ISSR分子標記技術。

[1]周喜旺,劉鴻燕,王娜,等.小麥種質資源BJ399抗條銹病基因的分子標記定位[J].麥類作物學報,2020,40(6):676-681.

[2]盧家仕,韋紹龍,黃素梅,等.基于ISSR分子標記的廣西香蕉種質資源遺傳多樣性分析[J].南方農業學報,2020,51(4):775-780.

[3]邱國俊,程敏,郭計華. ISSR分子標記技術在植物中的應用及其研究進展[J].興義民族師范學院學報,2020(1):117-120.

[4]戶帥雅,李斌奇,陳孝丑,等.紅掌遺傳多樣性及親緣關系的ISSR分析[J].福建農業學報,2020,35(1):20-27.

[5]趙依杰,林麗霞,姚立萍,等.福州地區柑橘種質資源的ISSR分析[J].農學學報,2020,10(1):72-76.

S513

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2095-1205(2020)04-65-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.04.32