小麥光溫敏雄性不育系穗發(fā)芽抗性鑒定及相關(guān)分子標(biāo)記驗(yàn)證

侯起嶺，趙昌平，楊衛(wèi)兵，高建剛，陳現(xiàn)朝， 楊吉芳，白秀成，張立平，張風(fēng)廷，孫 輝

(北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心/雜交小麥分子遺傳北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100097)

小麥穗發(fā)芽(pre-harvest sprouting，PHS)是指小麥在成熟期遇到連續(xù)陰雨天氣或處在潮濕環(huán)境下，籽粒在穗部發(fā)芽的現(xiàn)象。小麥穗發(fā)芽是一種世界性災(zāi)害，不僅導(dǎo)致籽粒產(chǎn)量降低，而且降低小麥加工品質(zhì)和種子質(zhì)量[1]。小麥光溫敏雄性不育系在可育條件下繁殖，在不育條件下制種，成熟期如遇連續(xù)陰雨天氣，將嚴(yán)重降低穗發(fā)芽率較高的不育系繁殖和雜交小麥制種的種子質(zhì)量。因此，抗穗發(fā)芽小麥不育系種質(zhì)的挖掘和抗穗發(fā)芽品種選育是雜交小麥育種的重要課題之一。

小麥穗發(fā)芽受多種因素的影響，包括籽粒休眠特性、穗部性狀、淀粉酶活性、植物內(nèi)源激素和外部環(huán)境(如溫度、濕度)等，其中籽粒休眠特性是主要因素[2-3]。小麥穗發(fā)芽的鑒定受外部環(huán)境因素影響較多，鑒定難度較大，目前主要鑒定方法有整穗發(fā)芽法、籽粒發(fā)芽法、大田發(fā)芽法、酶反應(yīng)生化標(biāo)記選擇法等。整穗發(fā)芽法、籽粒發(fā)芽法是常用方法；整穗發(fā)芽法能直觀反映品種的總體穗發(fā)芽抗性，籽粒發(fā)芽法主要反映籽粒的休眠特性，但不能反映品種穗發(fā)芽的綜合抗性。分子標(biāo)記輔助選擇法能夠從早代準(zhǔn)確選擇目標(biāo)，開發(fā)、驗(yàn)證并利用有效的分子標(biāo)記是鑒定小麥穗發(fā)芽抗性的有效方法之一[4]。

小麥穗發(fā)芽的抗性機(jī)制較為復(fù)雜，是由主效基因和微效基因(QTLs)控制的遺傳性狀，根據(jù)穗發(fā)芽抗性相關(guān)的QTL位點(diǎn)開發(fā)有效的分子標(biāo)記是分子標(biāo)記輔助育種的關(guān)鍵。目前，已發(fā)現(xiàn)了一系列與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的QTLs，主要集中在3AS和4AL染色體上[5]。Yang等[6]發(fā)現(xiàn)，Vp1基因的等位變異基因Vp1B與穗發(fā)芽抗性相關(guān)；標(biāo)記Vp1B3在抗穗發(fā)芽品種中可擴(kuò)增出845 bp或569 bp片段，在感穗發(fā)芽品種中可擴(kuò)增出652 bp片段。Mares等[7]在小麥籽粒顏色合成相關(guān)基因(R基因)的作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，位于4A染色體上的一個(gè)SSR標(biāo)記Xwmc468與小麥種子的休眠特性相關(guān)。劉光輝等[4]利用發(fā)芽指數(shù)和整穗發(fā)芽率作為小麥穗發(fā)芽抗性鑒定指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Xwmc468與穗發(fā)芽抗性相關(guān)。小麥TaSdr基因與水稻種子休眠相關(guān)基因OsSdr4是同源基因，對(duì)小麥種子休眠及穗發(fā)芽抗性起重要調(diào)控作用；基因序列分析表明，TaSdr-B1在其起始密碼子上游存在一個(gè)SNP(A/G)，A類型為TaSdr-B1a，G類型為TaSdr-B1b，通過RIL群體(Yangxiaomai/Zhongyou 9507)的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TaSdr-B1b基因型的GI(germination index)值顯著高于TaSdr-B1a基因型[8]。研究發(fā)現(xiàn)，TaMFT-A1基因位于小麥3AS上，可以調(diào)控小麥籽粒的休眠，抑制籽粒的萌發(fā)，與抗休眠QTL位點(diǎn)QTsg.osu-3A緊密關(guān)聯(lián)[9]。TaMFT-A1基因在春小麥品種中國(guó)春(Chinese Spring,CS)中與種子休眠調(diào)控有關(guān)，其Jagger等位變異類型在冬小麥和春小麥品種間存在差異[10]。Liu等[11]從白粒小麥Rio Blanco中克隆了一個(gè)位于小麥3AS染色體上的控制穗發(fā)芽抗性基因TaPHS1，該基因是TaMFT的同源基因，對(duì)小麥穗發(fā)芽抗性起正向調(diào)控作用。

小麥穗發(fā)芽抗性易受環(huán)境因素影響，很多已經(jīng)開發(fā)的分子標(biāo)記只在特定環(huán)境和遺傳背景下有效，很難在小麥育種中被廣泛應(yīng)用，已開發(fā)的標(biāo)記對(duì)于具有不同遺傳背景小麥的適用性和有效性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。鑒于此，本研究利用STS標(biāo)記Vp1B3，SSR標(biāo)記Xwmc468和基于小麥穗發(fā)芽抗性基因開發(fā)的KASP標(biāo)記TaSdr-B1、TaMFT-721J、TaPHS1-646和TaPHS1-646，結(jié)合整穗發(fā)芽法對(duì)88份小麥光溫敏雄性不育系進(jìn)行穗發(fā)芽抗性鑒定，以期篩選出抗穗發(fā)芽的不育系品系，為育種提供優(yōu)質(zhì)親本，同時(shí)篩選出能有效評(píng)價(jià)小麥光溫敏不育系穗發(fā)芽抗性的分子標(biāo)記，為雜交小麥育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心選育的88份不育系，于2018年秋季在北京順義試驗(yàn)基地(40°08′N，116°39′E)種植，試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組排列，每份材料4行，行長(zhǎng)1.5 m，株距 0.03 m，行距0.25 m，3次重復(fù)，常規(guī)田間管理。

1.2 方 法

1.2.1 整穗發(fā)芽率測(cè)定

參照Yang等[6]的方法并稍作調(diào)整，將穗發(fā)芽抗性水平劃分為4類，分別為高抗、中抗、中感和高感，對(duì)應(yīng)的發(fā)芽率依次為0～10%、10%～30%、30%～60%和60%～100%。在小麥蠟熟期，每個(gè)品系的每個(gè)重復(fù)選取成熟一致的主莖穗10個(gè)，室溫下自然風(fēng)干后置于-20 ℃冰箱存放，以維持種子休眠特性。所有供試麥穗都用0.5%的NaClO表面消毒20 min，在蒸餾水中浸泡洗凈，放在不同的塑料自封袋中，每個(gè)重復(fù)做好標(biāo)記，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽。發(fā)芽期間保持培養(yǎng)箱濕度，每天查看穗子發(fā)芽狀況。7 d后取出立即放置于60 ℃烘箱中烘干24 h，然后手工脫粒，記錄總穗粒數(shù)及發(fā)芽粒數(shù)，計(jì)算整穗發(fā)芽率(spike germination rate,SGR)。整穗發(fā)芽率=10個(gè)穗子總發(fā)芽籽粒數(shù)/10個(gè)穗子總籽粒數(shù)×100%。三次重復(fù)。

1.2.2 基因組DNA提取

每份材料取6～8粒種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，萌發(fā)后取適量葉片裝入2.0 mL的離心管中，加入鋼珠，液氮中研磨后用CTAB法[13]提取基因組DNA。

1.2.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

分子標(biāo)記引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。標(biāo)記Vp1B3和Xwmc468的PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括2×Mix混合液10 μL，模板DNA 2 μL(200 ng·μL-1)，上、下游引物各1 μL(2 μmol·μL-1)，ddH2O 5.0 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。Vp1B3的反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，Xwmc468的反應(yīng)產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

KASP標(biāo)記檢測(cè)采用QuantStudioTM7 Flex實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1.5 μL(50 ng·μL-1)，2×Master mix 0.75 μL，引物0.0417 μL，ddH2O補(bǔ)充至3.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋篒： 94 ℃ 15 min，1次循環(huán)；II：94 ℃變性20 s，61 ～55 ℃，60 s 10次循環(huán)(每次循環(huán)降低0.6 ℃)；III：94 ℃ 20 s，57 ℃ 60 s，26次循環(huán)。以ddH2O為空白對(duì)照。

表1 抗穗發(fā)芽相關(guān)分子標(biāo)記Table 1 Markers associated with PHS tolerance applied in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 22.0進(jìn)行方差及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試不育系材料的整穗發(fā)芽率

88份供試不育系材料的整穗發(fā)芽率為 3.75%～93.23%，平均整穗發(fā)芽率為45.49%，變異系數(shù)為0.59。由表2可知，各抗性等級(jí)間小麥整穗發(fā)芽率(SGR)差異明顯，SGR小于10%的材料有10份，平均值為 6.51%，占比為11.36%，抗性等級(jí)為高抗；SGR在10%～30%之間的材料有19份，平均值為 20.23%，占比為21.59%，抗性等級(jí)為中抗；SGR在30%～60%之間的材料有25份，平均值為39.22%，占比為28.41%，抗性等級(jí)為中感；SGR在60%～100%之間的材料有34份，平均值為75.69%，占比為38.64%，抗性等級(jí)為高感。

表2 供試材料整穗發(fā)芽分析Table 2 Analysis of sprouting of the tested materials

表3 88份小麥光溫敏雄性不育系的穗發(fā)芽抗性及6個(gè)標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物分析Table 3 PHS tolerance and amplified products of six markers in 88 wheat sterile lines

(續(xù)表3 Continued table 3)

2.2 不同穗發(fā)芽抗性標(biāo)記的有效性分析

2.2.1 STS標(biāo)記Vp1B3鑒定結(jié)果

由表3可知，在88份小麥光溫敏雄性不育系材料中，共擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為569 bp、652 bp和845 bp三種Vp1B3類型的條帶，分別命名為Vp1B3a、Vp1B3b和Vp1B3c，部分結(jié)果如圖1所示。供試材料中，擴(kuò)增出Vp1B3a類型片段的有24份，占供試材料數(shù)的27.27%，平均SGR為34.73%，變化范圍為3.75%～84.75%；擴(kuò)增出Vp1B3b類型片段的有59份，占供試材料數(shù)的67.05%，平均SGR為51.77%，變化范圍為 3.87%～ 93.23%；擴(kuò)增出Vp1B3c類型片段的有5份，占供試材料數(shù)的5.68%，平均SGR為23.12%，變化范圍為7.63%～42.00%。相關(guān)性分析表明，Vp1B3a類型片段與SGR值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；Vp1B3b類型片段與SGR值呈顯著正相關(guān)關(guān)系；Vp1B3c類型片段與SGR值相關(guān)性不顯著(表4)。擴(kuò)增出Vp1B3a和Vp1B3c類型片段的材料的平均SGR明顯低于Vp1B3b類型片段的材料，說明標(biāo)記Vp1B3可用于供試材料的穗發(fā)芽抗性鑒定。

M:D2000 marker; 1:BS104; 2:BS212; 3:BS252; 4:BS206; 5:BS283; 6:BS237.

2.2.2 SSR標(biāo)記Xwmc468鑒定結(jié)果

用標(biāo)記Xwmc468共擴(kuò)增出A、B、C和D共4種類型的片段，部分結(jié)果如圖2所示。擴(kuò)增出A類型片段的材料有9份，占總材料的10.23%，平均SGR為53.30%，變化范圍為4.73%～ 93.23%；擴(kuò)增出B類型片段的材料有65份，占供試材料的73.86%，平均SGR為46.91%，變化范圍為3.87%～91.68%；擴(kuò)增出C類型片段的材料有6份，占供試材料的6.82%，平均SGR為47.63%，變化范圍為8.39%～81.18%；擴(kuò)增出D類型片段的材料有8份，占供試材料的 9.09%，平均SGR為23.57%，變化范圍為 3.18%～34.38%。擴(kuò)增出D類型片段材料的SGR平均值明顯低于其他類型片段的材料。相關(guān)性分析表明A、B和C類型片段與SGR值的相關(guān)性均不顯著；D類型片段與SGR值呈顯著負(fù)相關(guān)(表4)。由此可見，標(biāo)記Xwmc468可用于供試材料的穗發(fā)芽抗性鑒定。

1:BS265; 2:BS104; 3:BS177; 4:BS293; 5:BS283; 6:BS182; 7:BS129; 8:BS270; 9:BS485; 10:BS166; 11:BS130.

2.2.3TaSdr-B1鑒定結(jié)果

用標(biāo)記TaSdr-B1在供試材料中共檢測(cè)出TaSdr-B1a和TaSdr-B1b兩種等位變異類型(圖3)。其中TaSdr-B1a等位變異類型有26份，占供試材料的29.55%，SGR平均值為45.06%；TaSdr-B1b等位變異類型有54份，占供試材料的61.36%，SGR平均值為46.33%(表3)。TaSdr-B1a和TaSdr-B1b兩種等位變異類型品系間的SGR值無顯著差異，二者與SGR的相關(guān)性均不顯著(表4)。

2.2.4TaPHS1-646鑒定結(jié)果

用標(biāo)記TaPHS1-646在88份供試材料中共檢測(cè)出Rio Blanco和NW97S186兩種等位變異類型(圖3)。其中Rio Blanco等位變異類型有78份，占供試材料的88.64%，SGR平均值為 42.99%；NW97S186等位變異類型有7份，占供試材料的7.95%，SGR平均值為76.20%(表3)。Rio Blanco和NW97S186兩種等位變異類型品系間的SGR值差異顯著；Rio Blanco等位變異類型與SGR值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，NW97S186等位變異類型與SGR值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(表4)。表明標(biāo)記TaPHS1-646可用于供試材料的穗發(fā)芽抗性鑒定。

2.2.5TaPHS1-666鑒定結(jié)果

用標(biāo)記TaPHS1-666在供試材料中共檢測(cè)出Rio Blanco和NW97S186兩種等位變異類型(圖3)。其中Rio Blanco等位變異類型有64份，占供試材料的72.73%，SGR平均值為44.10%；NW97S186等位變異類型有8份，占供試材料的9.09%，SGR平均值為70.19%(表3)。RioBlanco和NW97S186兩種等位變異類型品系間的SGR值差異顯著，Rio Blanco等位變異類型與SGR值相關(guān)不顯著，NW97S186等位變異類型與SGR值呈顯著正相關(guān)(表4)。

2.2.6TaMFT-721J鑒定結(jié)果

用標(biāo)記TaMFT-721J在供試材料中共檢測(cè)出Jagger和CS兩種等位變異類型(圖3)。其中Jagger等位變異類型有42份，占供試材料的 47.73%，SGR平均值為45.79%；CS等位變異類型有36份，占供試材料的40.90%，SGR平均值為46.56%(表3)。Jagger和CS兩種等位變異類型品系間的SGR值差異不顯著，二者與SGR的相關(guān)性均不顯著(表4)。

紅色點(diǎn)：HEX基因型；藍(lán)色點(diǎn)：FAM基因型；黑色點(diǎn)：空白對(duì)照。圖A為 TaSdr-B1標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果；圖B為 TaPHS1-646標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果；圖C為 TaPHS1-666標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果；圖D為 TaMFT-721J標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果。

3 討 論

穗發(fā)芽抗性是受多基因調(diào)控、多因素影響的復(fù)雜性狀，抗性機(jī)理十分復(fù)雜。目前已開發(fā)出很多與種子休眠或穗發(fā)芽相關(guān)的的分子標(biāo)記，但這些標(biāo)記對(duì)不同基因型小麥品種的有效性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究采用整穗發(fā)芽的鑒定方法，同時(shí)選擇6個(gè)被認(rèn)為與穗發(fā)芽相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)88份小麥光溫敏雄性不育系的穗發(fā)芽抗性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，整穗發(fā)芽率低于10%的有10份，占供試材料的11.36%，表現(xiàn)為高抗；在10%～30%之間的有19份，占比為21.59%，表現(xiàn)為中抗；這說明小麥光溫敏雄性不育系中存在豐富的抗穗發(fā)芽材料。其中有4個(gè)標(biāo)記的部分基因型與穗發(fā)芽抗性顯著相關(guān)，與前人研究結(jié)果一致[3-4,21]。本研究所用的6個(gè)分子標(biāo)記中，Vp1B3等位變異Vp1B3a和Vp1B3b與SGR顯著相關(guān)(P<0.01)；Xwmc468的D片段類型與SGR顯著相關(guān)(P<0.05)；TaSdr-B1和TaMFT-721J與SGR相關(guān)不顯著；TaPHS1-646與SGR值呈顯著相關(guān)(P<0.05)；TaPHS1-666的NW97S186單倍型與SGR顯著相關(guān)(P<0.01)。因此，標(biāo)記Vp1B3、Xwmc468和TaPHS1-646可用于小麥光溫敏雄性不育系穗發(fā)芽抗性的分子鑒定；KASP標(biāo)記TaPHS1-666可作為小麥光溫敏雄性不育系穗發(fā)芽抗性鑒定的參考標(biāo)記。

表4 分子標(biāo)記等位類型與SGR的相關(guān)性Table 4 Correlation between alleles and SGR

本研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記Vp1B3可用于小麥不育系穗發(fā)芽抗性鑒定，與前期研究人員的研究結(jié)果基本一致[3-4,6,12,14-17,19-25]；而楊 燕等[22]發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Vp1B3不適合紅粒小麥抗性篩選，孫果忠等[26]認(rèn)為，標(biāo)記Vp1B3難以用于品種的穗發(fā)芽抗性篩選，具體原因有待更多相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記Xwmc468可用于小麥不育系穗發(fā)芽抗性鑒定，與劉光輝等[4]，馬 麗等[16]，楊 燕等[22]研究結(jié)果一致。Zhang[8]等發(fā)現(xiàn)，TaSdr-B1b基因型的GI值顯著高于TaSdr-B1a基因型；Nakamura等[9]發(fā)現(xiàn)，TaMFT基因與籽粒休眠呈正相關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)，TaSdr基因的兩個(gè)等位變異的SGR差異不顯著，TaMFT-721J與SGR相關(guān)不顯著，與張維軍等[21]的研究結(jié)果一致。TaPHS1基因是在白粒小麥中發(fā)現(xiàn)的[11]。鄒景偉等[18]利用基于TaPHS1基因開發(fā)的KASP標(biāo)記對(duì)120份小麥進(jìn)行了抗穗發(fā)芽基因檢測(cè)，可顯著提高小麥育種效率；張維軍等[21]發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記Phs646、Phs666可用于寧夏引黃灌區(qū)小麥穗發(fā)芽抗性的分子鑒定；而本研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記TaPHS1-646與SGR顯著相關(guān)，TaPHS1-666的NW97S186單倍型與SGR顯著相關(guān)，與前人研究結(jié)果不完全一致的原因可能是穗發(fā)芽抗性與溫度、濕度、激素和穗部性狀等因素有關(guān)，另外標(biāo)記對(duì)品種和生態(tài)區(qū)可能具有特異型。

本研究發(fā)現(xiàn)，整穗發(fā)芽率與抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記不完全對(duì)應(yīng)，如BS184的SGR值為4.81%，BS286的SGR值為28.13%，分別屬于高抗和中抗穗發(fā)芽品系，但6個(gè)分子標(biāo)記均未檢測(cè)到抗穗發(fā)芽基因型，推測(cè)這些材料有可能攜帶有其他未被發(fā)現(xiàn)的抗性基因；BS141的SGR值為 84.75%，BS169的SGR值為68.60%，BS111的SGR值為67.15%，都屬于高感穗發(fā)芽品系，但分子標(biāo)記TaPHS1-646、TaPHS1-666和Vp1B3的檢測(cè)結(jié)果均為抗穗發(fā)芽基因型； BS291的SGR值為34.38%，屬于中感穗發(fā)芽品系，但分子標(biāo)記TaPHS1-646、Vp1B3和Xwmc468檢測(cè)結(jié)果均為抗穗發(fā)芽基因型。這些結(jié)果說明小麥穗發(fā)芽抗性是受多基因控制的復(fù)雜性狀，受自身休眠特性、籽粒顏色、穗部性狀和外源激素等因素影響；現(xiàn)有的分子標(biāo)記都是在特定的生態(tài)區(qū)和不同材料構(gòu)建群體開發(fā)出來的，對(duì)品種具有特異性。因此，小麥穗發(fā)芽抗性鑒定要綜合利用表型鑒定和分子鑒定，對(duì)不同區(qū)域不同類型的材料進(jìn)行分子鑒定時(shí)要進(jìn)行有效性檢驗(yàn)，鑒定結(jié)果會(huì)相對(duì)準(zhǔn)確。

綜合整穗發(fā)芽抗性鑒定和分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，篩選出BS212、BS143、BS206、BS129、BS117和BS237共計(jì)6份具有較低SGR值的不育系種質(zhì)資源。在小麥光溫敏雄性不育系選育和強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合配制中可以對(duì)這6份不育系材料加以利用。