鏈霉菌劑種子包衣對小麥幼穗分化及生物學特性的影響

劉玉濤, 楊 斌，張 凱, 馬軍妮, 溫宏偉，來航線, 薛泉宏

(1.西北農林科技大學資源環境學院, 陜西楊陵 712100；2.山西農業大學小麥研究所， 山西臨汾 041000； 3.有機旱作山西省重點實驗室， 山西太原 030000)

我國是全球最大的小麥消費國。隨著人口持續增長與可利用耕地面積不斷縮小，保障小麥單產水平對我國糧食安全的重要性日益突顯[1]。化肥對小麥單產提高發揮了重要作用[2]，但連年過量施用化肥使其利用率大幅降低[3]，土壤板結及肥力下降，造成土壤生物多樣性減少[4]、土壤和地下水污染等嚴重的環境問題[5-6]。在這種背景下，提高小麥產量且對生態環境友好的新型綠色生物技術受到了廣泛關注[7]。

大量研究證實，接種有益菌可促進小麥生長。Zaheer等[8]發現，接種巴西固氮螺菌與根瘤菌能顯著提高小麥產量、生物量、千粒重以及葉片表面蠟質含量。Danish等[9]研究表明，接種根瘤菌對小麥產量相關性狀及葉片養分含量有正效應。Emami等[10]發現，接種假單胞菌顯著提高了小麥生物量與微量元素同化率。Chandra等[11]在干旱脅迫條件下接種產ACC脫氨酶的熒光假單胞菌，發現小麥生物量、株高以及葉片養分含量均增加。Essiane-Ondo等[12]和Ma等[13]研究表明，接種叢枝菌根真菌可提高小麥產量與鋅含量。

目前，關于微生物提高小麥產量的研究多集中于細菌及真菌，鮮有關于放線菌促進小麥生長的報道。作為放線菌的最大屬，鏈霉菌主要被用于醫用抗生素生產及農作物病害生物防治[14-15]。研究發現，鏈霉菌除了合成抗生素外，還能產生顯著刺激作物生長的IAA等激素類物質，在微生物促生領域具有很大的應用價值與前景[16]。小麥的幼穗發育與分化受IAA、GA3等激素的調控，其含量直接影響成穗率、穗大小和結實性，最終對小麥產量形成產生重要影響。現有研究缺乏微生物對小麥穗發育進程及相關生物學特性影響的系統研究，難以對微生物的增產機理做出合理解釋。因此，本研究利用具有產鐵載體、IAA、ACC脫氨酶及解磷功能的2株鏈霉菌[17]發酵菌劑對小麥種子進行包衣，通過田間試驗研究鏈霉菌種子包衣對小麥穗發育進程的影響，并對小麥不同生育時期的生物學、生理生化特性及產量相關性狀進行研究，旨在探明鏈霉菌種子包衣對小麥的效應，為采用微生物技術提高小麥單產提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設計

供試小麥品種：小偃22號，由本課題組保存。

供試鏈霉菌：婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesroche,D74)和密旋鏈霉菌(Streptomycespartum,Act12)，由西北農林科技大學資源環境學院微生物資源研究室分離鑒定。鏈霉菌粉D74、Act12中的有效活菌數分別為3.5×1010cfu·g-1、2.3×108cfu·g-1，將其按質量比1∶1進行混合,得到混合菌劑。

種子包衣處理：參照劉玉濤等[18]方法進行。2015年，按種子質量的5%、10%(相當于每粒種子包衣量為2.5 mg、5 mg，分別用T2.5、T5表示)用量將D74與Act12混合菌粉撒入已加膠結劑的小麥種子中攪拌，使菌劑均勻包裹在小麥種子表面，晾干即可。2016年，減少包衣量，按種子質量的4%、8%(相當于每粒種子包衣量為2 mg、 4 mg，分別用T2、T4表示)進行包衣。

小區試驗：2015年10月13日將對照(CK，種子不做任何處理)、包衣處理(T2.5、T5)的種子種植于陜西楊陵鵬程生物科技公司試驗田。隨機區組排列，3次重復，小區面積為34.2 m2(18.0 m×1.9 m)，按照行距20 cm進行人工開溝點播，每行播70 g種子。底肥為復合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15)1 020 kg·hm-2與有機肥(有機質含量≥40%)3 660 kg·hm-2，一次性施入。2016年，按照設計在原試驗區重復種植方案。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 生物學性狀測定

分別在小麥分蘗期(2015年12月26日)與返青期(2016年2月25日)，每小區隨機選取10株代表性植株，測定單株鮮重、0～20 cm土壤根系鮮重、初生根與次生根數量和鮮重。分蘗數測定參照彭 靜等[19]方法進行。

分別于灌漿中期(2016年5月19日)及灌漿末期(2016年5月24日)，每個小區隨機采10株小麥穗，統計每穗的小穗數、每個小穗的籽粒數、穗粒數、籽粒鮮重和干重。

1.2.2 光合特性及生理生化指標測定

在灌漿前期(2016年5月5日)、灌漿中期(2016年5月19日)采用SPAD-502葉綠素儀測定小麥旗葉葉片SPAD值；采用LI-6400P光合儀測定小麥旗葉的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)，按公式(1)計算單葉水分利用率(Wue)。為保證試驗一致性，SPAD與光合速率測定在同一片旗葉上進行，測定時間均為上午9:00-12:00。方法：每個小區隨機選取8株具有代表性的小麥植株，在植株旗葉中部做好標記，先測定旗葉葉片SPAD值，后在相同部位測定光合速率。每處理共測定24片旗葉。

單葉水分利用率(WUE)=凈光合速率(Pn)/蒸騰速率(Tr)

(1)

葉片過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和硝酸還原酶活性及可溶性蛋白含量、MDA含量及根系活力測定參照趙 娟等[20]方法。植物樣品：分蘗期樣品以2015年12月26日測定分蘗期生物學性狀所采全植株為供試材料；灌漿期以2016年5月19日測定光合作用的植株旗葉(每小區取5株)為供試材料。植株與葉片處理方法：分蘗期，將每個小區5株幼苗的所有葉片剪下，洗凈剪碎后充分混勻，每個小區1個混合樣，從3個重復小區共得到3份小區葉片混合樣；灌漿期，將每個小區所采5株小麥的旗葉剪下，洗凈后剪碎混勻，共得到小區旗葉混合樣3份。3次重復。

按以上方法采樣，所得生物學與生化性狀測值均來自相同植株；葉片SPAD值、光合速率及生化特性測值均來源于相同葉片，以保證生物學與生化特性相關分析所用材料相同。

1.2.3 穗發育進程觀察

在小麥幼穗發育特征比較明顯的生長錐形成期、單棱期、二棱期、護穎分化期、小花原基分化期和雌雄蕊原基分化期，分別從田間選取長勢均一、具有代表性的CK、T2.5及T5處理的小麥幼苗主莖，在解剖鏡下觀察幼穗結構，計數各種類型的原基數，并用ToupView軟件拍照。

1.2.4 產量相關性狀測定

收獲期樣品采集及產量測定：在小麥收獲前1天采樣。2015年，每個小區隨機選取2個1 m2的樣區收獲，測定穗性狀(單位面積有效穗數、每穗小穗數、穗粒數、千粒重)和產量；采樣區外小麥實收，單獨脫粒、曬干稱重，與取樣區籽粒合并，計算實際產量。2016年，每小區隨機選取1行收獲(每行面積均為3.8 m2)，帶回實驗室，剪下麥穗，混勻，按10%抽樣，所抽樣品用于穗性狀分析，剩余部分曬干脫粒稱干重，合并計算產量。

按單穂質量>2 g為大穗、1～2 g為中穗、<1 g為小穗劃分標準，統計每個處理中的大、中、小穗數量及所占比例；統計每穗中4、3、2、1粒小穗的個數及其所占比例。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 20進行數據處理，測定結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 鏈霉菌包衣對小麥幼穗分化的影響

鏈霉菌包衣可加快小麥幼穗分化，使分化期提前。如圖1A顯示，在生長錐伸長期，鏈霉菌包衣處理的生長錐的長度較對照明顯增加，生長錐的長度呈現T2.5>T5>CK的趨勢。從圖1B可看出，在單棱期，鏈霉菌包衣處理的小穗原基的凸起程度明顯高于對照，當T2.5和T5處理生長錐上的小穗原基凸起已相當明顯，且出現多個小穗原基時，對照的生長錐仍然保持光滑狀態，尚無明顯的小穗原基形成；小穗原基凸起程度呈現T5>T2.5>CK的趨勢。

從圖2A和圖2B可看出，在二棱期至護穎分化期，對照中已完成分化的小穗原基較少，鏈霉菌包衣處理的小穗原基數量明顯多于對照。當對照的幼穗正處在二棱期，小穗原基上還未分化出其他穗結構時，鏈霉菌包衣處理幼穗上的大部分小穗已進入護穎分化期，小穗原基上面已明顯分化出小穗頂端生長錐、小花原基、外稃、穎片等結構。

c：小穗原基；d：小穗頂端生長錐；e小花原基；f：外稃；g：穎片；h：頂端小穗。

由圖3A和圖3B可看出，在雌雄蕊原基分化期，對照和菌劑包衣處理的小穗原基上的部分小花原基雖然都有雌蕊原基、雄蕊原基分化形成，但對照小花原基上分化出的雌、雄蕊原基數量較少，且分化程度低；從對照小穗原基的第一朵小花原基上分化出的雌、雄蕊原基數量少，而從鏈霉菌包衣處理小穂原基上的第一朵小花原基上分化出的雌、雄蕊原基數量多。

表1 鏈霉菌種子包衣處理對小偃22單個幼穗分化的影響Table 1 Effect of seed coating treatment of Streptomyces on single panicle differentiation of Xiaoyan 22

由表1可知，在小麥幼穗分化過程中，與對照相比，鏈霉菌包衣處理小麥在二棱期分化出的小穗原基數顯著高于對照(P<0.05)，在護穎分化期，鏈霉菌包衣處理T2.5和T5處理的小穗原基數、小花原基數均較對照顯著增加(17.3%和 16.0%、542.6%和474.5%，P<0.05)。在小花原基分化期，鏈霉菌包衣處理小麥較對照的頂端花原基數顯著增加(P<0.05)。說明鏈霉菌包衣處理顯著加速了小麥幼穗的分化進程，使各分化期提前。隨著幼穗繼續分化，到雌雄蕊原基分化期包衣處理小麥較對照的雌雄蕊原基數和頂端花原基數差異均不顯著，說明鏈霉菌包衣處理僅加速了幼穗的分化進程，使各分化期提前，但對小穗數量無顯著影響。

2.2 鏈霉菌包衣對小麥生物學特性的影響

由表2可知，鏈霉菌包衣對小麥不同生物學特性影響程度不同。在分蘗期，T2.5處理植株總鮮重及根系鮮重分別較對照增加29.4%及 50.0%，差異均顯著(P<0.05)。在返青期，T2.5和T5處理的根系鮮重均較對照增加75.0%，差異均顯著(P<0.05)。其余被測指標在各處理間差異均不顯著。

表2 鏈霉菌包衣對小麥單株生物學特性的影響(N=30，2015)Table 2 Effect of Streptomyces inoculation on biological characteristics of single wheat

2.3 鏈霉菌包衣對小麥葉片生化特性及根系活力的影響

由表3可知，在分蘗期，T2.5處理的小麥葉片POD活性較對照提高21.2%，差異顯著(P< 0.05)；灌漿期，T5處理的小麥旗葉PPO活性較對照提高29.4%，差異顯著(P<0.05)。其余菌劑包衣處理對小麥葉片POD、PPO、PAL活性均無顯著影響。

由表3可知，在灌漿期，包衣處理對小麥旗葉MDA含量、硝酸還原酶活性及根系活力有明顯影響，其中，T5處理的小麥旗葉MDA含量較對照降低36.8%，差異顯著(P<0.05)；T2.5和T5處理的小麥旗葉硝酸還原酶活性較對照分別提高37.4%、65.9%，差異均顯著(P<0.05)；T5處理小麥根系活力較對照增加24.3%，差異顯著(P<0.05)；兩種包衣處理的小麥旗葉可溶蛋白含量較對照均有增加，但差異不顯著。在分蘗期，包衣處理的葉片MDA含量及根系活力與對照均無顯著差異。

2.4 鏈霉菌包衣對小麥光合特性的影響

鏈霉菌劑包衣在灌漿期對小麥葉片各光合參數均具有一定程度的影響(表4)。在灌漿初期，除胞間CO2濃度之外，T2.5和T5處理的其余被測指標均高于對照，其中T5處理的凈光合速率較對照顯著提高(41.6%)。在灌漿中期，所有被測指標在兩種包衣處理與對照間的差異均不顯著。

表3 鏈霉菌包衣處理對小麥葉片生化特性及根系活力的影響(N=15，2015)Table 3 Effect of seed coating with Streptomyces on biochemical characteristics of wheat leaves and root activity

表4 接種鏈霉菌對小麥光合特性的影響(N=24，2015)Table 4 Effect of Streptomyces inoculation on photosynthetic characteristics of wheat

表5 鏈霉菌菌粉種子包衣處理對小麥穗性狀的影響(N=30, 2015)Table 5 Effect of seed coating treatment of Streptomyces on spike characters of wheat

2.5 鏈霉菌包衣對小麥產量及相關性狀的影響

從表5可知，灌漿末期，T2.5和T5處理的穗粒重(鮮重)較對照分別增加14.8%和11.1%，差異均顯著(P<0.05)。鏈霉菌包衣對有效穗數、千粒重和小穗數均無顯著影響，但對穗粒數影響明顯，T2.5處理的大、中、小型穗穗粒數均較對照增加，其中大型穗的穗粒數增幅最大。盡管鏈霉菌包衣處理對穗粒數的影響從統計學角度未達到顯著水平，但T2.5處理的產量較對照提高了 4.9%，差異顯著(P<0.05)，這是由于小麥的群體很大，雖然單位面積有效穗數和千粒重沒有明顯變化，但穗粒數的微小增加也會引起小麥單產較大幅度地提高。

由圖4可知，不同處理群體中的大、中、小型麥穗所占比例不同，其中，T2.5處理的大型穗所占比例較對照增加30.8%，差異顯著(P<0.05)，中型穗比例略有增加，小型穗所占比例較對照降低22.7%，差異顯著(P<0.05)。由表6可知，在灌漿末期，T2處理的大型穗比較對照增加 50.9%，差異顯著(P<0.05)，小型穗占比較對照減小；在收獲期，T2和T4處理的大穗占比均較對照增加，小型穗占比均較對照減小。

從圖5a看出，菌劑包衣處理對小麥穗中不同粒數小穗所占比例影響明顯。在灌漿中期，T2.5和T5處理的4粒小穗分別占其小穗總數的19.9%和23.0%，較對照分別提高27.6%和 47.4%，差異均顯著(P<0.05)；2粒小穗所占比例較對照分別增加10.7%和3.1%，前者差異顯著(P<0.05)；1粒小穗所占比例較對照分別下降9.5%和39.3%，后者差異顯著(P<0.05)，表明菌劑包衣能提高小麥結實數，增加多粒小穗比例。從圖5b看出，灌漿末期的測定結果整體具有類似趨勢。

SS：小穗； MS：中穗； LS：大穗；CK：對照；*表示處理與對照間差異在0.05水平達到顯著。下同。

4GS：4粒小穗； 3GS：三粒小穗； 2GS：二粒小穗； 1GS：1粒小穗，下同。

從圖6可知，菌劑包衣影響大、中、小型麥穗中不同粒數小穗所占比例。在大型穗中(圖6a)，T2.5和T5處理的4粒小穗所占比例較對照分別增加43.2%和降低24.8%，差異均顯著(P< 0.05)，1粒小穗所占比例較對照分別降低34.5%和增加45.1%，差異均達顯著水平(P<0.05)。在中型穗中(圖6b)，T2.5處理的4粒小穗較對照降低 64.0%，差異達顯著水平(P<0.05)。在小型穗中(圖6c)，T2.5和T5處理3粒小穗所占比例均較對照有所增加，1粒小穗所占比例均較對照有所減少，但差異均未達顯著水平。說明適量菌劑包衣可提高不同穗型中多粒小穗的比例，從而增加穗粒數；但菌劑使用量過大，則會降低多粒小穗的數量。

從表6可知，灌漿末期，T2和T4處理的穗粒重(干重)分別較對照增加16.9%和13.1%，差異均顯著(P<0.05)；T2處理的大穗百分比較對照提高50.9%，差異顯著(P<0.05)。T2和T4處理的產量均較對照有所提高。結合兩年試驗結果(表5、表6)分析可知，適當濃度的鏈霉菌包衣可以提高小麥產量，穗粒數的增加是增產的主要途徑，鏈霉菌包衣量過大則有抑制作用。

圖6 鏈霉菌劑對大(a)、中(b)、小型穗(c)的穗粒數影響Fig.6 Effect of Streptomyces on the number of grains per spike of large(a), medium(b) and small panicle(c)

表6 鏈霉菌菌粉種子包衣處理對小麥穗性狀的影響(2016)Table 6 Effect of seed coating treatment with Streptomyces on spike characters of wheat

3 討 論

研究表明，微生物促進作物生長的可能機制為：產生IAA、CTK等植物激素類物質，促進植株生長[10, 21-22]；生物固氮或溶解土壤中不能利用的磷、鉀和鐵等礦質元素，提高土壤養分的可利用性[8, 10, 23-27]；產生ACC脫氨酶、胞外多糖等物質，提高作物對干旱、鹽脅迫等逆境的抗性[9, 11, 28-31]。

本試驗所用兩株鏈霉菌系本項目組分離篩選自中國西北極端生境，其中，Act12能產IAA和ACC脫氨酶，并具有解磷和產鐵載體的能力[17]。前期盆栽試驗發現，接種Act12和D74混合菌劑有效提高了小麥種子發芽率和發芽指數，對苗期小麥葉片酶活力提高有明顯促進作用[18]。本研究進一步開展田間試驗并發現，采用Act12和D74菌劑進行小麥種子包衣，能加速小麥穗分化過程。

小麥幼穗分化過程一般分為生長錐伸長期、單棱期、二棱期、護穎分化期、小花分化期、雌雄蕊形成期、藥隔形成期和四分體形成期[38]。其中，二棱期至頂小穗形成期對小麥產量影響最大[39]。本研究發現在穗發育過程中，接種鏈霉菌不僅在二棱期至雌雄蕊原基分化期能夠加快穗發育進程(圖1-3)，這對促進穗器官的建成具有重要意義。推測該促進作用的可能原因：接種鏈霉菌刺激了小麥根系尤其是次生根和根毛的生長，促進其對N、P等礦質養分的吸收，充足的養分為穗器官形態建成提供了必要的物質[40]；鏈霉菌Act12和D74除了產IAA、ACC脫氨酶、解磷和產鐵載體的能力之外，還產生6-芐氨基嘌呤、激動素及脫落酸等(待發表)，這些植物激素可能對小麥穗分化過程產生影響；供試菌還可能產生赤霉素等代謝產物，而適宜的赤霉素濃度可促進小穗、小花分化，但濃度過高則抑制小穗、小花分化[41]。本研究中，處理T2.5(低濃度)增加了小花原基和雌雄蕊原基數量，但處理T5(高濃度)降低了小花原基和雌雄蕊原基數量，從側面證實了植物激素的存在及其作用的推論。

本研究表明，鏈霉菌Act12和D74混合菌劑包衣，在分蘗期對小麥根系鮮重具有顯著促進作用，且在返青期對根系鮮重的促進作用更為明顯。在返青期，接種鏈霉菌劑的小麥初生根條數較對照減少，但次生根條數和鮮重大幅度增加，植株總鮮重也較對照有所提高。研究發現，促生細菌通過產生IAA刺激小麥根系生長發育[32]，降低初生根的生長速度[33]，增加次生根的數量和長度[34-35]，并刺激根毛生長[36]，增加對礦質元素和水分的吸收，最終促進整個植物生長[32, 37]。這種促生效應隨著作物的生長發育具有累積性[37]，在小麥生長早期尤為明顯[37]。

本研究發現，鏈霉菌包衣提高了小麥葉片POD、PPO活性和可溶性蛋白含量，降低了MDA含量，這4個生化指標與植物抗逆性密切相關，其中，POD和PPO具有清除活性氧的能力；可溶性蛋白增加可提高細胞滲透調節能力；MDA降低有利于維持細胞膜結構的完整性。這4個指標的變化反映出鏈霉菌包衣可誘導小麥氧化損傷修復機制，提高了小麥抵御逆境的能力。Qin等[42]與Zaheer等[8]的研究也得到了類似的結果。葉片硝酸還原酶和根系活力與氮素同化利用及養分吸收密切相關[37]，本研究發現，鏈霉菌包衣顯著提高了灌漿期小麥旗葉硝酸還原酶活性和根系活力，根系活力的提高對小麥吸收土壤養分、灌漿能力提高及產量增加有重要作用，這也與前期根系生物量的顯著增加結果吻合。此外，旗葉硝酸還原酶活性與蛋白質合成及籽粒形成呈正向關系，即酶活性愈高，產量愈高[46]。

旗葉是小麥灌漿期最主要的光合器官，其凈光合速率反映了光合能力[8]，最終決定了小麥產量[43]。本研究發現，在灌漿初期，鏈霉菌包衣顯著提高了小麥旗葉的凈光合速率，有效提高了葉片的光合能力。Ahmed等[44]和Zaheer等[8]發現接種細菌也能有效提高葉片凈光合速率。

本研究發現，鏈霉菌包衣可增加小麥穗中多粒小穗比例及大穗率，通過增加穗粒數提高小麥產量，但對小穗數和千粒重沒有明顯影響。其他研究表明，接種促生細菌對小麥千粒重、單位面積穗數和穗粒數均有促進作用[8, 24, 32, 45]。造成這種差異的機制尚待進一步研究。

4 結 論

采用適宜濃度的鏈霉菌劑進行種子包衣對小麥生育前期生物學特性影響顯著，能提高小麥葉片酶活性與光合能力；加速小麥穗分化進程；通過增加穗粒數提高小麥產量。