紫杉醇耐藥的食管鱗癌細胞株TE1/PTX的建立及其表型特征

高 娜，李岳衡，楊珍珍，高錚釩，李 靜，黨婧晗，許培榮，范天黎

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院藥理學系 鄭州 450001 2)鄭州人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心 鄭州 450003 3)鄭州大學藥學院實驗中心 鄭州 450001

病理上食管癌包括食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,ECA)和食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)兩大類，歐美地區(qū)ECA高發(fā)，而我國多為ESCC，其中河南是高發(fā)地區(qū)；ESCC發(fā)病后病程進展快速，易發(fā)生耐藥和轉(zhuǎn)移，ESCC患者的5 a生存率不到20%[1-2]。化學治療(簡稱化療)依然在ESCC的綜合治療中扮演著十分重要的角色，目前ESCC患者面臨的最大威脅就是化療耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移[3]。一線化療藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)作用于微管蛋白系統(tǒng)，通過促進微管蛋白組裝成微管并避免其解聚，使微管束排列異常，形成星狀體，從而使紡錘體失去正常作用，最終使癌細胞死亡。耐藥是PTX治療ESCC的主要弊端[4]，并且ESCC細胞一旦對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性往往會發(fā)生多藥耐藥[5]。細胞耐藥蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)標志物表達發(fā)生改變，往往表現(xiàn)出耐藥性和較強的侵襲轉(zhuǎn)移性。我們采取大劑量PTX間斷沖擊的方法誘導ESCC細胞TE1，以建立耐藥細胞株TE1/PTX，觀察耐藥細胞惡性表型的改變并探討耐藥機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(Biological Industries公司)；胰蛋白酶、超敏發(fā)光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；Transwell小室、低黏附6孔板(美國Corning公司)；基質(zhì)膠(美國BD公司)；結(jié)晶紫染色劑(天津市大貿(mào)化學試劑廠)；RIPA裂解液、檸檬酸、檸檬酸鈉、甘氨酸、10×PBS、Tris堿、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(北京索萊寶科技有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；濃鹽酸、氯化鉀(天津市登科化學試劑公司)；預染蛋白Marker(美國Fermentas公司)；鼠抗人β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；兔抗人P-gp抗體、兔抗人MRP1抗體、兔抗人BCRP抗體、兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人N-cadherin抗體、兔抗人Slug抗體、兔抗人Vimentin抗體(美國Abcam公司)。

1.2細胞來源、培養(yǎng)及傳代TE1細胞系購于中國科學院腫瘤細胞庫。細胞生長狀態(tài)良好，密度達到90%以上時傳代。吸棄原來的培養(yǎng)基，用PBS洗2～3次，加入胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基終止消化，收集細胞用培養(yǎng)基重懸，按照所需比例傳代后于培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分數(shù)5%CO2)中培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)和傳代過程中用到的培養(yǎng)基均是含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.3耐藥細胞株TE1/PTX的建立采用大劑量PTX沖擊誘導TE1的方法建立TE1/PTX。取對數(shù)生長期TE1細胞，給予100倍半數(shù)抑制濃度(IC50)，即3 mg/L的PTX，沖擊誘導2 h，隨后用新鮮培養(yǎng)基換掉加藥培養(yǎng)基。每天觀察細胞狀態(tài)，及時更換培養(yǎng)基，待細胞出現(xiàn)克隆現(xiàn)象后傳代2～3次，再次進行沖擊誘導，共沖擊3次。之后延長藥物作用時間，每次誘導4 h，重復7次。總計沖擊10次，共需時8個月。細胞耐藥指數(shù)(RI)大于10，則說明耐藥細胞株TE1/PTX成功建立。

1.4TE1/PTX的RI和交叉耐藥性檢測將TE1/PTX或其親本細胞TE1單細胞懸液接種至96孔板中，每孔5.0×103個細胞，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度PTX(0.00、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56 mg/L)，ADM(0.00、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mg/L)和5-FU(0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40、12.8、25.60 mg/L)的培養(yǎng)基100 μL/孔，每種藥物每個濃度設置3個復孔。PTX干預24/48 h，ADM干預48 h，5-FU干預72 h，然后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入8 μL CCK-8溶液和92 μL RPMI 1640 37 ℃孵育細胞2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔450 nm波長處的吸光度(A)值，以反映細胞活性，繪制增殖曲線，計算IC50及RI。RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.5細胞形態(tài)觀察和增殖能力的檢測

1.5.1 細胞形態(tài) 于倒置光學顯微鏡下觀察并記錄TE1及TE1/PTX細胞的形態(tài)。

1.5.2 增殖曲線 將TE1及TE1/PTX細胞接種于24孔板中，每孔1.0×104個，每隔一天取3孔計數(shù)細胞取平均值，共21 d。以時間(T)作為橫坐標，細胞數(shù)(N)為縱坐標繪制增殖曲線。按照Td=Tlg2/lg(Nt/N0)計算倍增時間；其中Td為倍增時間(單粒為h)，T為從N0增殖到Nt所用的總時間，Nt為第t天的細胞數(shù)，N0為最初的細胞數(shù)。

1.5.3 細胞平板克隆形成能力 取處于對數(shù)生長期的細胞，6孔板中每孔鋪1 000個，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)。含有50個細胞以上的細胞團視為一個克隆。克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.6細胞周期的檢測離心收集TE1或TE1/PTX細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，加入預冷的體積分數(shù)70%乙醇后4 ℃過夜。用1 mL預冷的PBS重懸細胞(動作要輕柔)，離心并移去上清。加入RNaseA 100 μL混勻，37 ℃水浴30 min，加入PI染液500 μL混勻，室溫避光染色30～60 min，24 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.7遷移和侵襲能力的檢測①侵襲實驗：將基質(zhì)膠和無血清RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶4比例混勻。每個Transwell小室加100 μL混合液后，于37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h。待基質(zhì)膠凝固后，吸出剩余液體，下室加入600 μL RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分數(shù)20%胎牛血清)，上室中加入200 μL密度為5×105個/mL的TE1或TE1/PTX單細胞懸液(不含血清)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸出上室液體，漂洗、晾干，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色1 h，漂洗、晾干，在倒置光學顯微鏡下觀察，進行穿膜細胞計數(shù)。②遷移實驗：除不在上室涂布基質(zhì)膠外，其他步驟均與侵襲實驗相同。

1.8TE1/PTX細胞中耐藥蛋白表達的檢測TE1或TE1/PTX細胞用PBS漂洗2～3次，完全吸棄PBS，用已配好的裂解液(現(xiàn)用現(xiàn)配)于冰上裂解30 min(期間不時混勻)。把蛋白吸至EP管中，置于冰上，超聲破碎儀破碎，14 000 r/min離心10 min，然后BCA法測蛋白濃度。蛋白于100 ℃金屬浴中變性5 min，冷卻后-80 ℃保存。取20 μg總蛋白樣品用于聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白。電泳時，設置電壓為90 V，約30 min跑完濃縮膠，然后調(diào)節(jié)電壓為120 V，繼續(xù)電泳至跑完分離膠，在100 V電壓下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后加一抗β-actin(1∶5 000)、BCRP(1∶5 000)、MRP1(1∶1 000)、P-gp(1∶2 000)、E-cadherin(1∶10 000)、N-cadherin(1∶5 000)、Slug(1∶1 000)及Vimentin(1∶1 000)抗體在4 ℃孵育過夜。次日，用TBST漂洗PVDF膜30 min，加二抗山羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000)孵育2 h，再次用TBST漂洗30 min，然后按照儀器要求步驟進行曝光。采用Image J分析圖像結(jié)果。實驗重復3次。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析，兩種細胞各指標的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1TE1/PTX細胞的形態(tài)學觀察親本細胞TE1排列均勻，細胞之間連接緊密，形態(tài)正常，邊緣清晰。與親本細胞TE1比較，耐藥細胞株TE1/PTX的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，大多數(shù)細胞失去了正常形態(tài)，細胞變長且無規(guī)則，邊緣模糊且出現(xiàn)聚團生長的現(xiàn)象(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下TE1(A)和TE1/PTX(B)細胞的形態(tài)變化(×200)

2.2TE1/PTX細胞的耐藥性PTX、5-FU、ADM對TE1和TE1/PTX的IC50見表1。與親本細胞TE1相比，TE1/PTX對PTX有較高的耐藥性，對5-FU、ADM具有一定的交叉耐藥性，RI分別為13.01(PTX 24 h)、14.62(PTX 48 h)、3.50(5-FU 72 h)、1.80(ADM 48 h)。TE1和TE1/PTX的耐藥蛋白表達水平見圖2和表2。

表1 TE1和TE1/PTX細胞的藥物敏感性

圖2 TE1和TE1/PTX細胞中耐藥蛋白的表達

表2 TE1和TE1/PTX細胞中耐藥蛋白表達的比較

2.3TE1/PTX的增殖能力增殖曲線見圖3；平板克隆形成實驗結(jié)果見圖4。與TE1比較，TE1/PTX細胞Td延長，克隆形成率降低，見表3。

圖3 細胞增殖曲線

圖4 TE1(A)和TE1/PTX(B)細胞平板克隆形成實驗結(jié)果

表3 TE1和TE1/PTX細胞Td和克隆形成率的比較

2.4TE1/PTX細胞的細胞周期變化細胞周期檢測結(jié)果見表4。與親本細胞TE1相比，TE1/PTX的G2/M期細胞比例增加，S期細胞比例減少。

2.5TE1/PTX細胞的遷移、侵襲能力及EMT標志物的表達遷移、侵襲實驗結(jié)果見表5；EMT蛋白標志物檢測結(jié)果見圖5和表6。與親本細胞TE1比較，TE1/PTX的遷移及侵襲能力均提高；EMT蛋白標志物中間質(zhì)表型標志物N-cadherin、Slug表達升高。

表4 TE1和TE1/PTX細胞周期的比較 %

表5 TE1與TE1/PTX遷移和侵襲能力的比較

表6 TE1/PTX與TE1細胞EMT標志物表達的比較

3 討論

化療對許多腫瘤而言是一種必不可少的治療手段，但化療不可回避的問題就是腫瘤細胞的化療耐藥，甚至有時化療還能促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。PTX作為腫瘤化療的一線藥物，其耐藥機制的研究尤為重要。最近有研究[6-9]證實PTX和ADM在化療過程中誘導腫瘤細胞形成外泌體，促進了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。我們采取大劑量間斷沖擊的方法誘導TE1對PTX耐藥，從而建立ESCC耐藥細胞株TE1/PTX，為ESCC耐藥分子機制的研究提供細胞模型。

我們成功建立了耐藥細胞株TE1/PTX。親本細胞TE1排列均勻，細胞之間連接緊密，形態(tài)正常，邊緣清晰；而TE1/PTX大多失去了正常形態(tài)，細胞變長且無規(guī)則，邊緣模糊且聚團生長。TE1/PTX對PTX產(chǎn)生了耐藥，RI達到10以上，同時對5-FU和ADM也產(chǎn)生了一定的交叉耐藥。有文獻[10]報道ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運蛋白是一組跨膜蛋白,能以主動轉(zhuǎn)運的方式完成藥物分子的跨膜轉(zhuǎn)運，從而介導化療藥物外排，以促進腫瘤細胞的多藥耐藥。因此我們采用Western blot法檢測TE1與TE1/PTX細胞中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達，結(jié)果顯示，與TE1細胞相比，TE1/PTX中MRP1、P-gp表達上升。與親本細胞TE1比較，TE1/PTX倍增時間延長，克隆形成能力下降，且細胞主要分布在G2/M期。有研究[11]報道耐藥細胞株更多停留在靜止期G0/G1期，活躍期S期的細胞數(shù)減少。與TE1細胞相比，TE1/PTX細胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移能力顯著升高，在蛋白水平上表現(xiàn)為間質(zhì)表型標志物N-cadherin、Slug表達升高，這也證實了化療耐藥可促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

以上研究結(jié)果表明TE1/PTX產(chǎn)生了穩(wěn)定的多藥耐藥表型，并且其耐藥機制可能與ABC轉(zhuǎn)運蛋白和EMT標志蛋白的表達變化有關，而具體的分子機制有待進一步探索。