一個(gè)Cockayne綜合征家系的臨床特征及致病基因突變分析

黃娜娜，卞莎莎，王青青，楊 科，婁桂予，霍曉東，廖世秀

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院；河南省人民醫(yī)院；河南省醫(yī)學(xué)遺傳研究所；河南省遺傳性疾病功能基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家衛(wèi)生健康委出生缺陷預(yù)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450003

Cockayne綜合征(Cockayne syndrome，CS；MIM#133540，216400)是一種缺乏核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)而引起的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，屬于罕見的常染色體隱性遺傳病；于1936年由Cockayne報(bào)道第一例而得名[1]。CS臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，主要包括嚴(yán)重生長(zhǎng)障礙，進(jìn)行性加重的神經(jīng)和認(rèn)知功能障礙，早衰、小頭畸形、大耳、眼窩凹陷、皮膚異常光敏性、皮下脂肪減少等[2]。CS患者不僅早衰而且早逝，大多于20歲之前死亡[3]，多逝于惡病質(zhì)伴發(fā)的呼吸衰竭或腎臟衰竭[4]。CS具有高度遺傳異質(zhì)性，目前已知的致病基因主要是ERCC8(也稱Cockayne syndrome A，CSA)和ERCC6 (Cockayne syndrome B，CSB)[5]，亦有文獻(xiàn)[6]報(bào)道XPB、XPD、XPG基因缺陷與CS 發(fā)病相關(guān)。在西歐國(guó)家新生兒發(fā)病率為2.77×10-6[7]，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究分析了一個(gè)來(lái)自河南地區(qū)的CS家系，通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)ERCC8基因復(fù)合雜合突變?yōu)樵摷蚁抵虏⌒酝蛔儯贿M(jìn)一步針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用Sanger測(cè)序驗(yàn)證該家系的突變位點(diǎn)，并據(jù)此對(duì)該家系進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象先證者，男，10歲，籍貫河南，2018年2月23日以“發(fā)現(xiàn)發(fā)育落后8 a”為代主訴入院，就診于河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所門診。家系圖見圖1。該家系先證者父母非近親結(jié)婚且表型正常，先證者弟弟(2016年生，圖1中的Ⅱ3)亦有相似癥狀(發(fā)育遲緩、智力低下、小頭畸形、對(duì)光敏感等)，已走失，未能采集到樣本；一妹妹表型正常(圖1中的Ⅱ2)；嬰兒發(fā)育正常(圖1中的Ⅱ4)。本研究經(jīng)過(guò)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者及其家屬的同意，所有受試者/監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

圖1 CS家系遺傳圖譜

1.2方法

1.2.1 外周血全基因組DNA的提取 用EDTA抗凝管采集3 mL先證者及其父母、妹妹外周靜脈血3 mL，使用QLAamp血液DNA純化mini試劑盒提取外周血基因組DNA，使用Qubit dsDNA HS試劑盒對(duì)樣品DNA進(jìn)行定量及質(zhì)量控制，并-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高通量測(cè)序 按照Agilent公司SureSelectXT Target Enrichment System試驗(yàn)流程，采用捕獲方法對(duì)2 742個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)Illumina Nextseq 500二代測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。排除突變位點(diǎn)多態(tài)性后,發(fā)現(xiàn)ERCC8基因(NM-000082.3)上兩個(gè)可疑突變位點(diǎn)。

1.2.3 Sanger測(cè)序 采用Sanger測(cè)序?qū)ο茸C者及家系成員進(jìn)行突變驗(yàn)證。根據(jù)NCBI GenBank序列，利用Primer 5.0軟件對(duì)上述兩個(gè)可疑突變位點(diǎn)進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)，引物由上海擎科生物有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min變性；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，由上海擎科生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 可疑突變位點(diǎn)引物序列

1.2.4 產(chǎn)前基因診斷 先證者母親再次妊娠時(shí)于孕中期超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹穿刺抽取胎兒絨毛組織10 ng，排除絨毛樣本母體組織的污染后利用復(fù)合熒光標(biāo)記短串聯(lián)重復(fù)序列方法(Promega，PowerPlex 16 HS)提取胎兒基因組DNA，對(duì)ERCC8基因兩個(gè)可疑突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 使用在線軟件mutationtaster(http：//www.mutationtaster.org/)對(duì)篩出的可疑變異的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。采用ClustalX-2.1-win軟件將突變氨基酸與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),分析突變氨基酸在物種進(jìn)化過(guò)程中的保守性。

2 結(jié)果

2.1臨床特征分析先證者，男，10歲，消瘦，體重13 kg，身高96 cm，頭圍43 cm，BMI 14.11 kg/m2，呈明顯惡病質(zhì)體型。面容衰老，眼窩凹陷，大耳，小下頜，面部大片狀蛻皮蛻屑，散在點(diǎn)狀灰褐色色素沉著，口腔可見齲齒(圖2)；拇指內(nèi)收，雙下肢肌張力增高，踝關(guān)節(jié)背曲受限，雙腳骨骼畸形(圖2D)，指鼻試驗(yàn)不能配合；無(wú)法獨(dú)自站立，膝關(guān)節(jié)攣縮，腱反射亢進(jìn)。先證者頭顱磁共振提示：小腦蚓部發(fā)育不良，大枕大池、后枕部蛛網(wǎng)膜囊腫及腦積水；繼發(fā)性腦萎縮改變；基底節(jié)區(qū)鈣化灶 (圖3)。胎兒頭顱磁共振未提示明顯異常(圖4A)。先證者弟弟亦有相似癥狀：發(fā)育遲緩、智力低下、小頭畸形、對(duì)光敏感等。該家系患者臨床表型符合CS診斷。

2.2隨訪結(jié)果

2.2.1 先證者隨訪結(jié)果 先證者近10個(gè)月體重?zé)o明顯增長(zhǎng)，身高無(wú)明顯增長(zhǎng)，其余典型癥狀仍存在，齲齒加重。

2.2.2 胎兒隨訪結(jié)果 孕22周、25周及30周四維超聲檢查均未見異常；孕32周、37周超聲檢查示胎兒生長(zhǎng)發(fā)育可(雙頂徑、頭圍、估測(cè)體重等均符合正常孕周標(biāo)準(zhǔn))；孕33周胎兒頭顱磁共振檢查未見明顯異常；分娩后1個(gè)月隨訪，嬰兒發(fā)育正常，未見CS表型(圖4B)。

A～C：小頭，面容衰老，眼窩凹陷，大耳，小下頜，面部片狀蛻皮蛻屑，散在點(diǎn)狀灰褐色色素沉著；D：雙腿膝、踝關(guān)節(jié)屈曲攣縮

A：頭顱MRI T1加權(quán)像，示繼發(fā)性全腦萎縮；B：頭顱MRI T1加權(quán)像，示腦室擴(kuò)大，雙側(cè)基底節(jié)區(qū)對(duì)稱性斑片狀高信號(hào)影；C：頭顱MRI(矢狀位)T1加權(quán)像，示腦室擴(kuò)大，小腦蚓部發(fā)育不良,枕大池?cái)U(kuò)大；D：頭顱MRI T2加權(quán)像，示腦溝、腦裂增寬加深

A1、A2：胎兒頭顱磁共振未見明顯異常；B1、B2：嬰兒出生后1個(gè)月隨訪照片，未見CS表型

2.3基因檢測(cè)及產(chǎn)前診斷結(jié)果測(cè)序結(jié)果提示先證者存在ERCC8基因復(fù)合雜合突變，包括第1外顯子無(wú)義突變c.37G>T(p.E13*)和第4外顯子上缺失移碼突變c.394-398 delTTACA (p.L132fs*6)。第4外顯子c.394-398 delTTACA的缺失移碼突變?cè)?32位氨基酸處引起移碼，導(dǎo)致在基因序列中過(guò)早引入終止密碼子，使氨基酸編碼蛋白提前終止，產(chǎn)生一個(gè)含有136個(gè)氨基酸的截短蛋白。第1外顯子上的c.37G>T突變引起編碼第13位谷氨酸(Glu)的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子，造成ERCC8氨基酸序列提前終止，由正常編碼的396個(gè)氨基酸變?yōu)?2個(gè)氨基酸。同片段序列分析結(jié)果表明ERCC8 c.37G>T來(lái)源于患兒母親，c.394-398 delTTACA來(lái)源于患兒父親；先證者妹妹ERCC8 c.394-398 delTTACA突變同樣來(lái)源于父親。先證者的父母、妹妹均為正常臨床表型攜帶者。產(chǎn)前基因診斷結(jié)果提示胎兒基因組DNA ERCC8基因c.37和c.394-398位點(diǎn)均為野生型，不攜帶與先證者相同的致病性突變(圖5)。

2.4保守性分析見圖6。CSA蛋白第13位及132位氨基酸在8個(gè)不同的物種間幾乎完全相同，表明在進(jìn)化上高度保守。

Ⅱ1及Ⅰ2存在ERCC8 c.37G>T (p.E13*)，Ⅰ1、Ⅱ2及Ⅱ4此點(diǎn)為野生型(反向)；Ⅱ1及Ⅰ1 、Ⅱ2存在ERCC8 c.394-398 delTTACA (p.L132fs*6)，Ⅰ2及Ⅱ4此點(diǎn)為野生型(正向)

圖6 CSA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、突變位置及8個(gè)物種ERCC8基因的保守性分析

3 討論

CS是一種罕見的進(jìn)行性加重的多系統(tǒng)遺傳性疾病，其臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，除有進(jìn)行性生長(zhǎng)障礙、神經(jīng)和認(rèn)知功能障礙外，亦可能會(huì)有進(jìn)行性聽力喪失、色素性視網(wǎng)膜病等，其中色素性視網(wǎng)膜病是最常見的眼部疾病，占60%～100%[8]。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道CS患者會(huì)表現(xiàn)出腎臟的急慢性損害，急性腎病和腎衰竭是患者晚期死亡的重要原因之一，因此對(duì)CS患者進(jìn)行視聽功能檢測(cè)、腎臟功能監(jiān)測(cè)有助于協(xié)助診斷。該先證者視力、聽力及腎功能未發(fā)現(xiàn)異常，眼底檢查未能征得家屬同意。據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道，大部分的CS患兒有頭顱CT或MRI異常表現(xiàn)，如腦萎縮、雙側(cè)側(cè)腦室擴(kuò)大、髓鞘形成低下、鈣化等，因此完善頭顱影像學(xué)檢查對(duì)該病的早期診斷尤為重要。根據(jù)病情的嚴(yán)重程度和發(fā)病時(shí)間，CS可分為3個(gè)亞型： Ⅰ型(OMIM:133540)又稱經(jīng)典型，患兒2歲左右開始出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)，如發(fā)育遲緩、運(yùn)動(dòng)和語(yǔ)言功能的倒退、皮膚光敏感等；3歲時(shí)沒有小頭畸形被認(rèn)為是Ⅰ型CS的排除標(biāo)準(zhǔn)[1]。Ⅱ型(OMIM:216400)又稱早發(fā)型、重型，常表現(xiàn)為胎兒發(fā)育不良，出生后即可出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。Ⅲ型(OMIM:216411)又稱遲發(fā)型，通常在青少年晚期方出現(xiàn)體格發(fā)育遲緩或停滯，進(jìn)展緩慢，可存活到成年[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有CS患兒身高和體重最終均在中位數(shù)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以下[1]。本家系先證者臨床表現(xiàn)、頭部影像學(xué)檢查及基因檢測(cè)結(jié)果均支持CSAⅠ型診斷。CSA患者病情呈進(jìn)行性加重，尚無(wú)有效的治療措施，因此遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷十分必要。

CS具有高度遺傳異質(zhì)性，且致病性變異熱點(diǎn)因地域、種族背景不同而異。已知與CS發(fā)病相關(guān)的基因有ERCC6、ERCC8、XPB、XPD、XPG等5個(gè)，這些基因與損傷修復(fù)、氧化應(yīng)激和慢性退行性疾病相關(guān)[11]，其中90%的CS患者是由于ERCC6和ERCC8基因突變所致[6]。目前為止，已發(fā)現(xiàn)與CSA相關(guān)的ERCC8突變有57種，其中多集中于WD4 和WD5區(qū)域[2]，由此可見WD結(jié)構(gòu)域在 CSA 的生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。ERCC8基因位于染色體5q12.1，包括12個(gè)外顯子，編碼的CSA蛋白具有396個(gè)氨基酸，屬于Swi2 /Snf2家族的WD40重復(fù)蛋白，由7個(gè)色氨酸-天冬氨酸(WD)重復(fù)基序和β螺旋結(jié)構(gòu)組成，其通常參與促進(jìn)多蛋白復(fù)合物的形成[12]，其中β-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物形成和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用提供支架[2]。有文獻(xiàn)[10,13]報(bào)道CSA蛋白是E3泛素連接酶復(fù)合物的底物靶向組分，此復(fù)合物由DDB1(DNA損傷結(jié)合蛋白1)、RBX1和CUL4A5組成，在轉(zhuǎn)錄、偶聯(lián)以及DNA修復(fù)機(jī)制中起重要作用，且CSA蛋白通過(guò)此種修復(fù)作用使細(xì)胞維持生理氧化還原狀態(tài)，減少衰老相關(guān)炎癥表型，從而保護(hù)細(xì)胞免于衰老。ERCC6基因編碼CSB蛋白，CSB蛋白被認(rèn)為有助于修復(fù)DNA氧化損傷和促進(jìn)線粒體DNA代謝[14]。在損傷位點(diǎn)，CSA蛋白與CSB蛋白相互作用，募集其他修復(fù)因子(XAB2，HMGN1，TFIIS)至損傷部位進(jìn)行修復(fù)[15]。CSA及CSB的轉(zhuǎn)錄、偶聯(lián)核苷酸切除修復(fù)缺陷易導(dǎo)致CS患者的光敏感性異常[16]。CSA患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變及生長(zhǎng)發(fā)育落后的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，該家系致病突變ERCC8 c.394-398 delTTACA (p.L132fs*6)位于WD2-WD3功能域之間，產(chǎn)生一個(gè)含有136個(gè)氨基酸的截短蛋白，造成了WD3功能域的改變及后4個(gè)WD功能區(qū)域的缺失；ERCC8 c.37G>T (p.E13*) 突變位于N-氨基末端，引起編碼第13位谷氨酸(Glu)的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子。這兩個(gè)突變導(dǎo)致CSA蛋白WD40功能域的缺失及其β-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，影響轉(zhuǎn)錄、偶聯(lián)及DNA修復(fù)，從而致病。本研究中生物信息學(xué)分析顯示這兩個(gè)突變位點(diǎn)在多種物種中具有高度保守性。查詢ExAC外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)在人群中突變頻率分別為8.29 4×10-6、3.30×10-5；這兩個(gè)突變位點(diǎn)雖有文獻(xiàn)[2,17]報(bào)道，但該復(fù)合雜合突變?yōu)槭状螆?bào)道，且經(jīng)Mutation Taster功能預(yù)測(cè)分析，提示這兩個(gè)突變?yōu)橹虏⊥蛔儭?/p>

總之，對(duì)本例CS家系的臨床影像學(xué)資料及基因突變分析，提高了對(duì)CS的認(rèn)識(shí)。對(duì)CS家系進(jìn)行基因突變分析及孕早期產(chǎn)前診斷，做到早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，可有效降低生育患病兒的風(fēng)險(xiǎn)。