一個線粒體腦肌病家系臨床表型及遺傳學分析

范麗媛，毛澄源，秦 潔，史長河，鄭惠敏，胡新超，張 槊，胡正威，范 雨， 董亞麗，楊 靖，許予明

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)鄭州大學醫學科學院 鄭州 450052

線粒體腦肌病(mitochondrial encephalomyopathy，ME)為線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和(或)核DNA(nDNA)缺陷導致線粒體結構和功能障礙，進而引起ATP合成障礙的一種疾病，主要累及骨骼肌和中樞神經系統[1]。ME包括ME伴乳酸中毒和卒中樣發作綜合征 (ME with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS)、慢性進行性眼外肌癱瘓(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO)、Kearns-Sayre綜合征等，其中MELAS為主要分型，約占80%[2]。MELAS常見于45歲以下女性[3]，累及多系統，多為母系遺傳病；其臨床表現及遺傳基因突變均缺乏特異性，且易誤診為癲癇、腦梗死、腦炎等[4-6]。肌肉活檢和基因檢測是診斷MELAS的重要手段。本研究對1個臨床表現不典型的ME家系進行了臨床表型及遺傳學分析,旨在幫助提高臨床診斷的準確率。

1 對象與方法

1.1先證者的一般資料和既往檢查結果女，63歲，因“陣發性胸悶、心慌20 d，再發、加重伴呼吸困難1 d”就診。患者20 d前無明顯誘因出現陣發性胸悶、心慌，伴呼吸困難、發熱(體溫最高達38 ℃)、乏力、流淚、盜汗，持續5～10 min自行緩解，2～3 d發作一次，多于早晨發作；活動后加重，休息后好轉。否認心臟疾病史、呼吸系統疾病史；2個多月前因“右上肢無力”于當地醫院就診；頭部CT示右側額葉片狀稍低密度影，雙側基底節區多發腔梗；頸動脈CTA增強檢查示頸動脈、椎動脈輕度硬化，雙側頸總動脈分叉部鈣化斑塊，管腔未見明顯狹窄；顱腦MRI示左側基底節區斑片狀新發梗死，雙側基底節區及額頂葉多發缺血腔梗灶，腦白質疏松；顱腦MRA示輕度腦動脈硬化，左側大腦后動脈P2段以遠顯示欠清。診斷為“急性腦梗死、高血壓病3級，極高危”，于外院治愈后出院，未遺留后遺癥。

1.2家系調查家系圖見圖1。先證者(Ⅱ5)父母已故，其父親死于心肌梗死，母親癥狀不詳；其2個哥哥、1個姐姐已故，其中1個哥哥(Ⅱ1)、1個姐姐(Ⅱ4)死亡前均表現為四肢無力；其女兒(Ⅲ1)，32歲，體健；其外孫女(Ⅳ1)，10歲，7 a前無明顯誘因出現運動遲緩，四肢無力。

圖1 ME患者家系圖

1.3入院后常規檢查包括體檢、實驗室檢查及影像學檢查。

1.4入院后針對性檢查

1.4.1 血乳酸、頭顱影像學及病理檢查 對先證者行血乳酸檢測。頭顱影像學檢查包括頭部MRI、頭部磁共振波譜(MRS)、頸部超聲。病理檢查：經先證者知情同意后，無菌操作下于其右股四頭肌處取直徑3 mm肌組織，經異戊烷和液氮速凍后切片，HE染色后光學顯微鏡下觀察。

1.4.2 遺傳學檢查 征得先證者、其女兒、其外孫女及一名正常人知情同意后，抽取靜脈血各10 mL于EDTA抗凝管中。采用線粒體DNA 抽提試劑盒提取DNA。Thermo ScientificTMNanoDropTMOne超微量紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度。提取的DNA樣本于-20 ℃保存。目標序列捕獲測序：將上述4人提取的線粒體基因組DNA樣本送北京金準基因科技有限責任公司進行線粒體基因檢測。Sanger測序驗證：采用Primer Premier 6.0軟件設計PCR引物，chrM:3243上游引物為5’-CCGCTATTA AAGGTTCGT-3’，下游引物5’-GGTGATGGTAGAT GTGGC-3’；chrM:3243-276上游引物為5’-ACT TCAAATTCCTCCCTGTACG-3’，下游引物5’-TCGT TCGGTAAGCATTAGGAA-3’。PCR反應體系(30 μL)：2×PCR Master mix 12 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 15 μL。正向測序PCR條件：95 ℃變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環，每循環降低0.6 ℃。反向測序PCR條件：95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環；72 ℃延伸10 min。 PCR產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小后，由北京金準基因科技責任有限公司進行Sanger測序。

2 結果

2.1家系臨床特征①該家系成員符合母系遺傳規律基因檢測的結論。先證者、先證者1個哥哥和1個姐姐及先證者外孫女均有發病癥狀。②臨床癥狀異質性大：先證者癥狀較明顯與復雜，如前所述；先證者1個哥哥和1個姐姐出現四肢無力癥狀；先證者女兒，無臨床癥狀；先證者外孫女臨床表現為運動遲緩，肌力下降，眼瞼下垂，其外院肌肉活檢結果可見破碎紅纖維，琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)染色在肌膜下深染，細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,COX)染色在部分肌纖維缺損等現象。

2.2入院后常規檢查結果體檢：體溫36.8 ℃，脈搏100 min-1，呼吸23 min-1，血壓159/100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，體重41 kg。下唇可見1 cm×1 cm皰疹。雙肺呼吸音清。心音有力，律齊，各瓣膜聽診區未聞及雜音。四肢肌張力、肌力及腱反射正常，病理征陰性。

實驗室檢查：血常規、糞便常規、B型腦鈉肽前體、超敏心肌肌鈣蛋白、傳染病篩查、甲狀腺素、谷草轉氨酶、糖化血紅蛋白、C-反應蛋白、抗核抗體、抗中性粒細胞抗體等均在正常范圍內。血肌酸酶同工酶27.6 U/L(正常值0.0～25.0 U/L)；紅細胞沉降率21 mm/h(正常值0～20 mm/h)；尿常規：隱血2+，葡萄糖1+，白細胞2+，紅細胞64個/μL(正常值0～7 個/μL)，白細胞64個/μL(正常值0～12個/μL)，未分類結晶256個/μL(正常值0～3個/μL)；活化部分凝血活酶時間21.30 s(正常值26.00～40.00 s)；降鈣素原0.050 μg/L(正常值0.000～0.046 μg/L)；血鉀3.42 mmol/L(正常值3.50～5.50 mmol/L)。

影像學檢查：胸部CT未見明顯異常。心臟超聲示2D及M型特征，CDFI示二尖瓣少量反流，左室舒張功能減低。HOLTER示竇性心律，全程平均心率和最低心率均低于正常范圍；偶發房性早搏、偶發短陣房性心動過速；ST-T未見明顯異常的動態變化；心率變異性低于正常范圍。動態血壓示夜間收縮壓平均值高于正常范圍；夜間血壓下降率減少；全天血壓呈弱杓型曲線。甲狀腺超聲示左側葉囊性結節(TI-RADS分級：2級)。腎臟超聲示右側輸尿管上段擴張并結石，右腎積水。肝臟、膽囊、胰臟、脾臟、子宮附件、膀胱超聲均未見明顯異常。

2.3先證者血乳酸、頭顱影像學和病理檢查結果血乳酸4.90 mmol/L(正常值0.63～2.44 mmol/L)。頭部MRI示雙側額頂葉、雙側半卵圓中心、雙側基底節區及雙側側腦室旁見點片狀長T1長T2信號影，黑水序列部分呈高信號，白質脫髓鞘。DWI高b值見左側基底節區異常信號，呈彌散受限高信號(圖2)。頸部超聲示雙側頸總動脈內中膜增厚，左側頸總動脈斑塊形成。HE染色示肌束內肌纖維排列緊密，肌纖維大小欠均勻，部分肌纖維邊緣嗜堿，胞漿呈顆粒狀改變，可見少量萎縮肌纖維呈角形或圓形，可見破碎紅纖維(圖3)。

A:T1圖像；B、C：T2圖像：D：T2-Flair圖像：E、F：DWI、ADC圖像

圖3 先證者肌肉活檢結果(HE，×400)

2.4遺傳學檢查結果目標序列捕獲測序及Sanger測序結果提示先證者及其女兒、外孫女線粒體基因組均存在chrM:3243A>G(tRNA Leu1)突變，先證者本人、其女兒、其外孫女突變負荷分別為89.58%、78.66%、49.90%。正常研究對象未檢測到此突變(圖4)。

A、B、C：分別為先證者、先證者女兒、先證者外孫女，可見線粒體chrM:3243位點存在突變：D：正常人，相應位點不存在突變

3 討論

研究[7-9]顯示，MELAS是一種進展性神經遺傳疾病，主要與mtDNA突變相關，其中mtDNA A3243G突變占80%，T3271C和A3252G突變約占15%。mtDNA突變會導致線粒體蛋白質合成受損，影響線粒體電子傳遞鏈復合體亞單位和線粒體能源的生產。線粒體功能失調無法產生足夠的能量來滿足器官功能，臨床表現會出現各器官不同程度障礙。因此，MELAS常因臨床表現復雜多變而被漏診或誤診。

MELAS最常見的癥狀是卒中樣發作、間斷性頭痛、抽搐、肌無力、運動不耐受、偏癱、精神異常等[10-11]，甚至還有視力下降[12]等癥狀，此外，還可累及其他系統。消化系統受累可表現為腹瀉、便秘、復發性胰腺炎、假性腸梗阻等；心血管系統受累可表現為擴張性心肌病、心臟傳導異常等；內分泌系統受累可表現為糖尿病、甲狀腺功能減退、性功能異常等[13]；泌尿系統受累可表現為腎小管疾病等[14-16]。本例先證者以“陣發性胸悶、心慌20 d，再發、加重伴呼吸困難1 d”起病，活動后加重，休息后好轉。之前研究中以類似癥狀起病的報道較少。先證者胸部CT、心臟彩超、HOLTER及ECG結果均不能解釋其癥狀，可排除心臟及肺部功能損傷，考慮為線粒體功能障礙所致。之前很多研究報道了MELAS不典型的起病癥狀，如以急性呼吸衰竭和肌酸激酶顯著升高起病[17]、反復發熱[18]、傳導性失語[19]等。此外，MELAS常表現為高乳酸血癥，提示線粒體呼吸鏈氧化酶功能障礙，當中樞神經系統受累時，腦脊液中乳酸水平也可能升高。本家系先證者血乳酸呈現異常升高。

診斷MELAS除了依賴詳細的病史外，肌肉活檢是一項重要手段。MELAS患者肌纖維中存在參差不齊的破碎紅纖維是最典型的病理表現，COX染色可見COX陰性和(或)陽性肌纖維，SDH染色可見破碎樣藍纖維及SDH強反應性血管。本家系先證者肌肉活檢HE染色示肌束內肌纖維排列緊密，肌纖維大小欠均勻，部分肌纖維邊緣嗜堿，胞漿呈顆粒狀改變，可見少量萎縮肌纖維呈角形或圓形，可見破碎紅纖維。需要注意的是，有研究顯示約10%MELAS患者肌肉活檢檢測不到破碎紅纖維[20]，且部分患者疾病初期只累積中樞系統[21]，因此肌肉病理未發現破碎紅纖維并不可以排除MELAS診斷。

核磁共振檢查是診斷MELAS的有力工具[22]。MELAS常累及大腦皮層及大腦皮層下的腦白質，部分病灶累積雙側基底核團，病灶常呈游走性和多變性[23]。MELAS MRI平掃表現為多發長T1、 長T2卒中樣信號,病變不按血管解剖分布。本家系先證者頭部MRI示雙側額頂葉、雙側半卵圓中心、雙側基底節區及雙側側腦室旁見點片狀長T1、長T2信號影，黑水序列部分呈高信號，白質脫髓鞘；DWI高b值見左側基底節區異常信號，呈彌散受限高信號。MRS可呈現高大乳酸雙峰，反映MELAS患者病變區域的乳酸水平，乳酸水平的升高常伴隨N-乙酰天門冬氨酸的下降[24]。

在詢問病史、臨床檢查以及實驗室檢查后，一般通過分子遺傳學方法來確診。通常可以通過單基因測序、基因組診斷、mtDNA測序或外顯子組測序，從血液或者其他標本(口腔黏膜、尿沉渣等)中檢測出致病突變[13]。本研究對家系內患者及正常研究對象行mtDNA檢測(包括目標序列捕獲測序及Sanger測序驗證)，發現先證者攜帶mtDNA A3243A>G突變，此為MELAS最常見致病突變位點。同時其女兒和外孫女外周血中亦檢測到該突變，結合家族史可確定該家系為母系遺傳。值得注意的是，先證者、先證者女兒和先證者外孫女基因檢測結果均為mtDNA A3243G突變，突變負荷由高到低分別為先證者(89.58%)、其女兒(78.66%)、其外孫女(49.90%)，但其女兒無癥狀，突變負荷呈復制分離現象和“瓶頸”效應，臨床癥狀與突變負荷無明顯線性關系。一般認為突變負荷和臨床表型的嚴重程度呈正相關，但也有研究[25]表明A3243G突變負荷達到80%以上的患者中，20%的患者并未出現嚴重癥狀。可能是因為存在多種mtRNA次級突變或復合突變以及核基因組的作用。曾有研究[26]在攜帶mtDNA A3243G突變的患者中檢測到56條核基因表達失調，提示核基因的突變可能會影響線粒體基因突變的患者的臨床表型。此外，不同組織中A3243G突變負荷的分布情況不同[27]，分裂旺盛的細胞如血細胞的mtDNA往往向野生型發展，而分裂不旺盛的細胞如肌肉組織出現突變mtDNA的累積，因此肌肉、尿液和毛發等標本中較外周血高。本報道中的家系樣本為血液，而ME受累組織多為神經系統組織和肌肉組織。往往血液中突變負荷較低，且不能代表受累組織的情況，因此與病情嚴重程度不成比例。但獲取肌肉組織和神經組織等多具有創傷性，因此許多研究在探索新的檢查如毛囊組織、尿上皮細胞等，這些組織中的突變負荷更接近肌肉中的突變負荷[28]。有研究[29]表明，不同個體、不同組織間存在閾值效應，當突變負荷達到某一臨界值時，野生型mtDNA的數量不足以維持呼吸鏈的功能，導致組織或器官功能出現異常。不出現臨床癥狀可能是由于其突變負荷尚未達到特定的致病閾值。

總而言之，MELAS臨床表現多樣，對本家系研究提示MELAS臨床表現可能不典型，應予以重視，通過詳細的病史、家族史，血乳酸值的檢查，影像學檢查，必要時結合肌肉活檢及基因檢測，來進一步確診，以防漏診。