經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道3與缺氧預(yù)處理大鼠腦梗死的關(guān)系

李婧靜，吳世政，薛孟周，李飛翔，聞 君，崔 健，劉偉利，吳 睿

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科 鄭州 450014 2)青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 西寧 810016

WHO數(shù)據(jù)顯示，腦卒中，也稱中風(fēng)、腦血管意外，已經(jīng)超越腫瘤，成為世界上繼冠心病后的第二大死因，其中缺血性腦卒中占85%[1]。內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制(缺氧預(yù)處理)在腦梗死治療中的作用受到眾多學(xué)者關(guān)注。研究[2]顯示，細(xì)胞、組織甚至機(jī)體在給予亞致死劑量的缺氧預(yù)處理后，致死劑量的缺血缺氧所帶來的損傷可被顯著降低。缺氧預(yù)處理可以增加組織細(xì)胞的缺氧耐受力，促進(jìn)細(xì)胞因子的生成，維持細(xì)胞活性和組織修復(fù)力[2-3]。缺氧預(yù)處理具有中樞神經(jīng)保護(hù)作用，可用于中風(fēng)的治療[4]。

鈣超載可損害神經(jīng)元，但也有研究[5]發(fā)現(xiàn)，不同途徑介導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)Ca2+水平升高可導(dǎo)致不同的結(jié)果，神經(jīng)元內(nèi)Ca2+水平相同的前提下，不同途徑進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+也可導(dǎo)致截然不同的結(jié)果。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential canonical channels，TRPC)是一類非選擇性的主要通透Ca2+的陽離子通道[6]，TRPC3與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡有關(guān)，并參與腦梗死的病理生理變化[7-9]。腦梗死所致的神經(jīng)損傷可被大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型模擬[4]。本研究觀察了缺氧預(yù)處理對MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死面積、TRPC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，探討缺氧預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來源及實(shí)驗(yàn)分組56只3月齡健康雄性SD大鼠，體重180～220(203.2±13.9) g，購于甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心統(tǒng)一飼養(yǎng)。隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組，每組14只。正常對照組(N組)：常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行缺氧預(yù)處理，不制備MCAO模型。梗死組(M組)：不進(jìn)行缺氧預(yù)處理，制備MCAO模型。缺氧預(yù)處理組(H組)：進(jìn)行缺氧預(yù)處理，但不制備MCAO模型。缺氧預(yù)處理加梗死組(HM組)：先進(jìn)行缺氧預(yù)處理，然后制備MCAO模型。

1.2干預(yù)方法及神經(jīng)功能評分缺氧預(yù)處理方法：連續(xù)3 d，每天上午8：00，將HM組、H組大鼠置于低壓氧艙(模擬5 000 m海拔，壓強(qiáng)0.53×105Pa，氧分壓42 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)中2 h，進(jìn)行急性缺氧預(yù)處理。預(yù)處理結(jié)束2 h后，行神經(jīng)功能評分，然后H組斷頭取腦，HM組行左側(cè)MCAO模型制作。MCAO制備：M組和HM組參照Longa方法，改良后建立大鼠MCAO模型，MCAO后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分。參照Longa的5級標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行神經(jīng)功能評分。N組不做任何處理，直接評分。

1.3腦梗死面積百分比測定M組和HM組神經(jīng)功能評分后，每組隨機(jī)選取4只斷頭取腦。將所取腦組織立即放入-20 ℃冰箱中冷凍5 min后取出，沿冠狀位自額極至枕葉行腦組織切片(厚約2 mm)，再立即用氯化三苯基四氮唑(TTC)37 ℃避光染色30 min，每5 min搖片一次。多聚甲醛固定，拍照。染色后，可明顯區(qū)分梗死區(qū)(蒼白色)和非梗死區(qū)(紅色)。將染色后的腦組織拍照，用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出腦梗死面積百分比。

1.4腦組織中TRPC3mRNA表達(dá)的檢測每組隨機(jī)選取6只大鼠，采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取腦組織總RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存。采用TaKaRa熒光定量試劑盒及ABI7500系統(tǒng)檢測TRPC3 mRNA的表達(dá)水平，以18S rRNA為內(nèi)參。通過查閱文獻(xiàn)并在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索，設(shè)計(jì)引物，由Qiagen公司合成，引物序列如下。TR PC3引物：上游5’-CCGCTATGTCCACCAAGGTC-3’，下游5’-GGATGTTGCCGTACTGCGT-3’；18S rRNA引物：上游5’-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3’， 下游5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 6 μL ，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCt法計(jì)算TRPL3 mRNA相對表達(dá)量。

1.5腦組織中TRPC3蛋白表達(dá)的檢測每組隨機(jī)選取4只大鼠灌注取腦，多聚甲醛固定1周。取出腦組織，自額極至枕葉5等分，取第3份腦組織，使用梯度乙醇(50%、70%、80%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ)進(jìn)行組織脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，切片(片厚3.5 μm)。用恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)烤片，60 ℃溫箱中烤片4 h，37 ℃溫箱中烤片48 h以上。用SV0003-羊IgG兩步法免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)檢測TRPC3蛋白。切片脫蠟、修復(fù)，滴加內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑，用50 g/L牛血清白蛋白封閉，加一抗(1∶500稀釋的羊IgG，英國Abcam公司)孵育，加HRP標(biāo)記的抗羊IgG二抗(英國Abcam公司)孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，返藍(lán)、分化，梯度乙醇脫水，封片固定，顯微鏡下觀察。以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為陽性染色。隨機(jī)觀察5個(gè)400倍視野利用Image Pro Plus 6.0軟件測定陽性染色區(qū)域光密度值，用以表示TRPC3蛋白表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。M組和HM組神經(jīng)功能評分及梗死面積的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，4組TRPC3表達(dá)水平的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能缺損和腦梗死程度N組和H組大鼠未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損，Longa評分均為0。腦組織TTC染色結(jié)果見圖1。N組、H組均染為紅色，說明未發(fā)生腦梗死。M組和HM組大鼠存在神經(jīng)功能缺損和腦梗死，但HM組梗死面積百分比低于M組(表1)；提示缺氧預(yù)處理單獨(dú)作用不損傷腦組織，并可以減輕MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損程度。

2.2大鼠腦組織中TRPC3的表達(dá)見圖2、表2。缺氧預(yù)處理增加大鼠腦組織中TRPC3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，MCAO造模則降低了大鼠腦組織中TRPC3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，缺氧預(yù)處理可以拮抗MCAO造模對大鼠腦組織中TRPC3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

圖1 腦組織TTC染色

表1 M組和HM組大鼠Longa評分和梗死面積百分比比較

A：N組；B：H組；C：M組；D:HM組

表2 4組大鼠TRPC3 mRNA和蛋白表達(dá)的比較

3 討論

腦梗死具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康。腦梗死所致的神經(jīng)損傷可被大鼠MCAO模型模擬[4]。哺乳動(dòng)物的大腦在缺血缺氧時(shí)極易受損，同時(shí)，缺氧預(yù)適應(yīng)可以增強(qiáng)哺乳動(dòng)物抵抗腦缺血缺氧代謝狀態(tài)的能力，保護(hù)神經(jīng)元。缺氧預(yù)處理可以使細(xì)胞、組織發(fā)生表型變化、功能轉(zhuǎn)變、耐受力增加，從而減輕缺血缺氧損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理可不損傷大鼠腦組織，縮小腦梗死面積，提示缺氧預(yù)處理具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用。

TRPC通道主要滲透Ca2+，其次滲透Na+，與許多病理生理過程有關(guān)，如內(nèi)皮細(xì)胞的完整、血管收縮、血管生成及氧化應(yīng)激等[12]。TRPC的表達(dá)具有細(xì)胞特異性，TRPC3主要表達(dá)于大鼠大腦皮層、海馬、杏仁核的神經(jīng)元和小腦的浦肯野纖維中[6]。腦梗死后的神經(jīng)元凋亡有Ca2+超載的參與，有研究[13]發(fā)現(xiàn)，TRPC3介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流也可發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)[13]表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的神經(jīng)元保護(hù)作用與TRPC3有關(guān)：在培育小腦顆粒細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TRPC3活性受到抑制時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，BDNF保護(hù)作用被削弱；而增高TRPC3表達(dá)可以減少神經(jīng)元凋亡。既往研究[14]表明，BDNF誘導(dǎo)的細(xì)胞存活機(jī)制依賴于Ca2+依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路，例如PLC/IP3R通路、ERK/CREB通路、PI3K/Akt/NF-κB通路。研究[15]顯示，TRPC3和TRPC6介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可引起B(yǎng)DNF誘導(dǎo)的突觸前線粒體聚集，進(jìn)而使突觸遞質(zhì)釋放增多。在培育海馬神經(jīng)元時(shí)發(fā)現(xiàn)，TRPC3在瘦素誘導(dǎo)的樹突形成過程中也是必不可少的。Dhar等[16]也發(fā)現(xiàn)，TRPC通道可能影響突觸生成。在Bcl-2和BDNF的協(xié)同作用下，NMDAR的激活可被抑制，細(xì)胞凋亡減少；TRPC3改善腦梗死的作用可能是通過參與Bcl-2和BDNF的生成及反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化實(shí)現(xiàn)的[15]。

腦梗死病理變化與內(nèi)皮功能有關(guān)，如血管源性水腫、細(xì)胞間水腫及出血轉(zhuǎn)化等。在哺乳動(dòng)物的內(nèi)皮細(xì)胞，TRPC3參與形成氧化還原敏感的雜聚肽離子通道；TRPC3可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，從而影響腦梗死時(shí)水腫的形成[6]。氧化應(yīng)激可激活內(nèi)皮細(xì)胞中的TRPC3[17]。體外培育內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)， Ca2+內(nèi)流及內(nèi)皮舒張因子(EDRF)的生成因細(xì)胞外酸中毒而減少，TRPC3參與了這一變化[18]。內(nèi)皮細(xì)胞的功能在炎癥、高血壓等疾病時(shí)發(fā)生改變，此現(xiàn)象或許涉及TRPC3[19-21]。也有研究[22]證實(shí)，TRPC3在心肌缺血再灌注損傷時(shí)，活性受到抑制，Ca2+內(nèi)流和NO的生成均減少。

本實(shí)驗(yàn)中， 缺氧預(yù)處理可以升高大鼠腦組織中TRPC3的表達(dá)，縮小MCAO大鼠腦梗死面積。我們由此推斷，缺氧預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過增加TRPC3的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，然而TRPC3神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制，及過表達(dá)TRPC3是否具有神經(jīng)毒性，需進(jìn)一步探索研究。