正源抗栓蜜丸對(duì)角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用研究

林希釩 王 振 何世勇 官睿璇 張 琳 郁萬(wàn)剛

1. 大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，遼寧 大連 116044；2. 大連市中醫(yī)中科研究院，遼寧 大連 116021

腦卒中是世界范圍內(nèi)的一種高發(fā)性、高危性腦血管疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占87%，其1年內(nèi)的致死率約10%，致殘率也高達(dá)34%[1]。中國(guó)缺血性腦卒中患者數(shù)目龐大，年輕化明顯，病死率和復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于世界平均水平，是家庭和社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，我國(guó)積極開(kāi)展腦卒中的防治工作，不斷加大對(duì)于腦卒中臨床和基礎(chǔ)研究的投入，取得了一定成績(jī)，但國(guó)內(nèi)腦卒中防治局勢(shì)依然嚴(yán)峻，防治手段有待進(jìn)一步優(yōu)化[2-3]。

血栓指血管內(nèi)有形成分相互作用、聚集所形成的團(tuán)塊狀固體，依據(jù)其形成部位的不同可分為動(dòng)脈血栓和靜脈血栓，以動(dòng)脈血栓最為常見(jiàn)。作為中樞器官，腦參與完成機(jī)體各種生命活動(dòng)，豐富的能量需求使得腦部血供系統(tǒng)復(fù)雜且脆弱，腦部血管易產(chǎn)生血栓而堵塞，導(dǎo)致周圍腦組織血供不足，引發(fā)缺血缺氧性變性及壞死，繼而影響腦的正常生理功能[2]。因此目前缺血性腦卒中的臨床治療多從血栓入手，主要采用溶栓和抗凝兩種方法，同時(shí)以支架置入術(shù)為主的介入治療也迅速發(fā)展，該病治愈率有所提高[3]。然而抗血小板治療抵抗、介入術(shù)后的再灌注損傷、抗凝藥物引起腦出血等問(wèn)題依舊嚴(yán)重，探尋更為有效的治療方法成為相關(guān)醫(yī)務(wù)工作者的首要任務(wù)[4-5]。

中醫(yī)藥作為中華民族的傳統(tǒng)瑰寶，其“辨證論治”的思想對(duì)于多種疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。對(duì)于缺血性腦卒中，中醫(yī)學(xué)者從氣血運(yùn)行理論出發(fā)，確立了活血化瘀為主，益氣補(bǔ)血相輔的治療理念，同時(shí)積極研發(fā)以心腦康膠囊、脈絡(luò)寧注射液為主要代表的現(xiàn)代中藥劑型，在實(shí)際臨床應(yīng)用中取得了相當(dāng)不錯(cuò)的效果[6-7]，為缺血性腦卒中的治療提供了更加廣闊的思路。

本課題組長(zhǎng)期致力于缺血性腦卒中的中醫(yī)藥療法，通過(guò)前期文獻(xiàn)調(diào)研并結(jié)合老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)確定以蝮蛇、黃芪為君藥，天麻、水蛭、丹參為臣藥；川芎、雞血藤、地龍為佐藥；麝香為使藥的關(guān)鍵復(fù)方，以中藥細(xì)粉配合蜂蜜制得便攜式蜜丸，取名正源抗栓蜜丸。其中蝮蛇、水蛭、地龍均屬蟲藥，其藥性善走，可祛風(fēng)通絡(luò)、除瘀消癥；黃芪、丹參、雞血藤活血通經(jīng)、益氣補(bǔ)虛；天麻、川芎、麝香消瘀止痛、養(yǎng)血活血。諸藥聯(lián)用，共奏活血化瘀、補(bǔ)虛通絡(luò)之效。同時(shí)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)水蛭能夠作用于纖維蛋白原、纖溶酶原等參與血栓形成的重要分子,調(diào)節(jié)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)和血小板活化[8]，從而實(shí)現(xiàn)抗血栓效應(yīng)；黃芪含有的黃芪總皂苷可增強(qiáng)前列腺環(huán)素合成酶活性，抑制血小板聚集；丹參通過(guò)抑制血栓素A2合成實(shí)現(xiàn)血小板聚集的抑制作用[9]；蝮蛇、天麻、川芎等能夠抗氧化應(yīng)激、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞以及促進(jìn)血管新生[10-12]。以上發(fā)現(xiàn)提示正源抗栓蜜丸具有良好的抗血栓和腦保護(hù)作用，能夠作為臨床治療缺血性腦卒中的潛力藥物。現(xiàn)探究正源抗栓蜜丸對(duì)角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用，為其下一步臨床應(yīng)用提供佐證。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性KM小鼠60只，體重為(25±5)g，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK-(遼)2018-0007]

1.2 藥品和器械 正源抗栓蜜丸(批號(hào)：20191012，規(guī)格：0.3 g)；心腦康膠囊(吉林密之康藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z22025480)；L型角叉菜膠(上海津頌實(shí)業(yè)有限公司)；水合氯醛(上海信裕生物科技有限公司)；生理鹽水(江西科達(dá)衛(wèi)生用品公司)；一次性使用無(wú)菌注射器(大連JMS醫(yī)療器具有限公司)；游標(biāo)卡尺(日本三豐儀器)；灌胃針頭(北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 將適應(yīng)性飼養(yǎng)一周的雄性KM小鼠隨機(jī)分為六組，即空白組、模型組、心腦康膠囊組(6.0 g·kg-1)、正源抗栓蜜丸低劑量組(1.0 g·kg-1)、正源抗栓蜜丸中劑量組(2.0 g·kg-1)和正源抗栓蜜丸高劑量組(4.0 g·kg-1)，每組10只。稱重后灌胃相應(yīng)藥物和生理鹽水，灌胃體積為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)7 d。

2.2 模型制備 依據(jù)文獻(xiàn)記述[14,17-18]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備小鼠尾部血栓模型。第7次灌胃后，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射L型角叉菜膠(40 mg·kg-1)并將其尾部浸入0～4 ℃冷水進(jìn)行低溫刺激，1 min后撈出并擦干。

2.3 數(shù)值測(cè)定 造模24 h后觀察小鼠行為變化并以10%水合氯醛(1 mL/300 g)進(jìn)行麻醉，然后以游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠尾部全長(zhǎng)以及血栓長(zhǎng)度，同時(shí)以組為單位拍攝小鼠尾部血栓照片。數(shù)值測(cè)定完成后處死小鼠。

3 結(jié)果

3.1 小鼠行為狀態(tài)的變化 空白組小鼠狀態(tài)如常，模型組小鼠飲食差、活動(dòng)性弱、畏冷，其余各組小鼠行為狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組，以正源抗栓蜜丸中劑量組小鼠最佳。

3.2 小鼠尾部血栓 造模24 h后，各組小鼠尾部不同程度地出現(xiàn)暗紅色血栓，同時(shí)部分小鼠尾部血栓干枯脫落形成斷尾。如圖1所示。

A.模型組；B.心腦康膠囊組；C.正源抗栓蜜丸低劑量組；D.正源抗栓蜜丸中劑量組；E.正源抗栓蜜丸高劑量組圖1 小鼠尾部血栓

3.3 小鼠黑尾率、尾部血栓長(zhǎng)度和尾部血栓相對(duì)長(zhǎng)度的比較 與空白組小鼠相比，模型組小鼠黑尾率達(dá)100%，尾部血栓約占全尾長(zhǎng)度的25%，差異顯著(P<0.01)，提示模型制備成功。與模型組小鼠相比，心腦康膠囊組小鼠及正源抗栓蜜丸高劑量組小鼠的黑尾率、尾部血栓長(zhǎng)度和尾部血栓相對(duì)長(zhǎng)度均有所降低，但差異不明顯(P>0.05)；正源抗栓蜜丸低、中劑量組小鼠的尾部血栓長(zhǎng)度、尾部血栓相對(duì)長(zhǎng)度以及正源抗栓蜜丸中劑量組小鼠的黑尾率降低，且差異顯著(P<0.01或P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 小鼠黑尾率、尾部血栓長(zhǎng)度和尾部血栓相對(duì)長(zhǎng)度的比較

4 結(jié)論

角叉菜膠又名卡拉膠、鹿角菜膠，屬于多糖混合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化工等諸多領(lǐng)域，分為K型 (Kappa) 、I型 (Iota) 、L型 (Lambda)三種，能夠刺激機(jī)體釋放以IL-1β為主的多種炎性因子，損傷血管內(nèi)皮的同時(shí)激活凝血酶、活化血小板，使血小板與受損的內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附，形成血小板小梁。而受損的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的凝血因子誘發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得血流速度減緩，大量紅細(xì)胞吸附在血小板小梁上，從而形成血栓[13]。角叉菜膠致小鼠尾部血栓之法乃胡三覺(jué)教授等[14]自國(guó)外引入，相較于創(chuàng)傷性手術(shù)造栓，該法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、人為因素干擾少、尾部血栓的形成十分直觀，該方法已在抗血栓類藥物的功效研究方面得到廣泛應(yīng)用[15-16]。劉彥霞等[17]發(fā)現(xiàn)相較于皮下注射，腹腔注射能夠顯著提高小鼠尾部出栓率和出栓速度，同時(shí)劑量、溫度、濕度等因素對(duì)于小鼠尾部出栓具有一定影響；張俊林等[18]認(rèn)為同等條件下雄鼠較雌鼠更易出栓，L型角叉菜膠較I型出栓率更高且血栓相對(duì)長(zhǎng)度更長(zhǎng)。故本課題組以雄性KM小鼠和L型角叉菜膠作為實(shí)驗(yàn)基本材料，通過(guò)腹腔注射造模，同時(shí)控制實(shí)驗(yàn)溫度為(15±5)℃，濕度為20%，以保證小鼠的出栓率，為探究正源抗栓蜜丸對(duì)小鼠尾部血栓作用提供基礎(chǔ)。

小鼠尾部?jī)H腹側(cè)一條尾動(dòng)脈,左右兩側(cè)以及背側(cè)血管均為靜脈，屬于典型的單動(dòng)脈供血，正常情況下血液沿尾動(dòng)脈從尾根向尾梢流動(dòng)，在流動(dòng)過(guò)程中與周圍組織細(xì)胞不斷進(jìn)行物質(zhì)交換以保證能量供應(yīng)，然后通過(guò)三條靜脈實(shí)現(xiàn)血液回流。小鼠腹腔注射角叉菜膠后，在炎性因子的刺激下發(fā)生血管內(nèi)皮的損傷，小鼠尾梢部分在24 h內(nèi)形成暗紅色血栓并不斷向尾根部延伸，由于缺少側(cè)枝循環(huán)，血栓形成區(qū)域逐漸變性壞死并干枯脫落，形成斷尾。與小鼠尾部血栓的發(fā)展相似，缺血性腦卒中病變后期由于長(zhǎng)期的缺血缺氧，腦組織氧化應(yīng)激明顯，并逐漸變性壞死，造成不可逆性病理?yè)p傷，使腦喪失正常生理功能，甚至于腦死亡[2,19]，同時(shí)腦部血栓的長(zhǎng)度與缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度具有明顯的正相關(guān)性。由此可見(jiàn)，小鼠尾部出栓率和血栓長(zhǎng)度的變化不但可以直接體現(xiàn)正源抗栓蜜丸的抑制血栓作用，而且在一定程度上能夠說(shuō)明正源抗栓蜜丸對(duì)于缺血性腦卒中的潛在療效。因此，在該研究中我們以小鼠黑尾率、小鼠尾部血栓長(zhǎng)度以及小鼠尾部血栓相對(duì)長(zhǎng)度作為關(guān)鍵指標(biāo)，通過(guò)對(duì)比不同組別間上述指標(biāo)的差異以確定正源抗栓蜜丸對(duì)于角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用，進(jìn)而說(shuō)明正源抗栓蜜丸治療缺血性腦卒中的潛能，這也與其他學(xué)者的研究相一致[12,15-16,20-21]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低、中劑量正源抗栓蜜丸均能顯著抑制小鼠尾部血栓形成，以中劑量效果最佳；同時(shí)高劑量正源抗栓蜜丸對(duì)小鼠尾部血栓形成的抑制作用反而不及低劑量有效，甚至與模型組無(wú)明顯差異(P>0.05)。我們認(rèn)為可能是由于高劑量組小鼠的實(shí)際藥物攝入量較低劑量組更低。例如，過(guò)高濃度藥物的攝入刺激小鼠的胃部神經(jīng)，使其反射性嘔吐，導(dǎo)致實(shí)際藥物攝入量降低。但我們?cè)趯?shí)際操作中并沒(méi)有明顯地觀察到這一現(xiàn)象。另一方面，這一反?，F(xiàn)象可能與藥物自身特性有關(guān)，實(shí)驗(yàn)中高劑量正源抗栓蜜丸藥物濃度可能位于倒“U”型濃度-作用曲線最適濃度的右側(cè)，與最適濃度間的距離甚至大于低劑量正源抗栓蜜丸，所以其抑制小鼠尾部血栓形成的效果不佳；再者，也可能是高濃度藥物抑制了小鼠對(duì)藥物本身的吸收或者促進(jìn)其排泄。

綜上所述，一定濃度的正源抗栓蜜丸能夠明顯降低小鼠黑尾率、尾部血栓長(zhǎng)度以及尾部血栓相對(duì)長(zhǎng)度，顯著抑制角叉菜膠致小鼠尾部血栓。鑒于正源抗栓蜜丸組分的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[8-12]以及角叉菜膠致小鼠尾部血栓與缺血性腦卒中發(fā)病的相似性，我們認(rèn)為正源抗栓蜜丸具有治療缺血性腦卒中的潛能，但具體療效如何，有待后續(xù)進(jìn)一步探討。