溪黃草水提物對酒精性肝損傷的保護作用研究

葉秋瑩 張黎黎 黃自通 許佳鑫 李元棟 吳泰逸 黃 輝 林冰淇 林妙倩

清遠職業技術學院食品藥品學院，廣東 清遠 511500

1 材料

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 溪黃草(Rabdosia serra (Maxim.) Hara)(湖北金貴中藥，批號：A180301)、聯苯雙酯滴丸藥品(廣州白云山星群藥業，批號：NF40005)購于陽光大藥房；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物 昆明小鼠，SPF級，雄性，體重18～22 g，均于南方醫科大學實驗動物中心采購，小鼠生產許可證號SCXK(粵)2016-0041。實驗條件溫度保持為20～25 ℃，相對濕度在40%～70%，飼養3 d后進行實驗。

2 方法

2.1 溪黃草水提液的制備 稱取6 g的溪黃草，加100 mL水，浸泡1 h，加熱煮沸，煮沸開始計時1 h，稍冷，用四層紗布過濾得中藥水煎液①。重復上述過程，用四層紗布過濾得中藥水煎液②。合并濾液，濃縮至20 mL，得質量濃度為 0.6 g/mL(以生藥量計)的藥液，置于 4 ℃冰箱中密封保存[8]。

2.2 動物分組造模及給藥 將48只SPF級健康雄性昆明小鼠隨機分為空白組、模型組(酒精：52°白酒)、陽性組(藥物：聯苯雙酯滴丸，200 mg/kg)、溪黃草組(6 g生藥/kg)4組，每組12只。每日空白組、模型組小鼠按0.1 mL/10g給予蒸餾水，陽性組、溪黃草組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃給藥，1次/d，共10 d。每次給藥后1 h，除空白組外的其余各組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃給予52°白酒造模，1次/d，共10 d。

2.3 樣本的采集 實驗結束末(實驗前禁食12 h，自由飲水)，小鼠眼球取血，離心分離血清，-20 ℃ 保存備用，之后頸椎脫臼處死小鼠，立即摘取肝臟，用預先冰浴滅菌的生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱取肝臟濕重，攤開進行拍照。取剩余部位組織若干塊，分別置10 mL EP管中，保存于-20 ℃備用。

2.4 指標觀察及測定方法

2.4.1 動物的日常情況 實驗期間每天觀察小鼠的行為活動、攝食、毛發、飲水及精神狀態等情況，做好觀察記錄。

2.4.2 肝臟形態及肝臟指數的計算 脫臼處死并解剖小鼠后，肉眼觀察并分析小鼠肝臟的病變情況(包括色澤、形態等)。

中國城市化進程即中國農村轉化成城市的過程。19世紀下半葉到20世紀中后期，中國城鎮化基本處于停滯狀態；改革開放以后，進程加快，最顯著的成就是中國城鎮化水平從1978年的17.92%提升到2016年的57.35%。城鎮化進程加快，意味著越來越多的農村人口轉變為城市人口或者半城市人口，意味著農村人口的生活方式、消費方式也逐漸趨向城市居民。代表著先進、文明、便利、舒適的城市消費文化對當代農民，尤其是農村青年產生了巨大的吸引力。這種無法抗拒的吸引力也逐漸在農村青年的婚姻生活打上了深深的烙印。

2.4.3 生化指標的檢測 取出存于-20 ℃的小鼠血清，梯度解凍，用試劑盒測試。按照試劑盒操作方法測定血清和肝臟中谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛 (MDA)的含量。

3 結果

3.1 溪黃草水提液對小鼠體重、肝臟重量、肝臟指數及一般情況的影響 實驗期間對小鼠進行一般體征觀察，空白組小鼠在攝食與飲水方面正常，毛色光亮，活動正常，其余各組均出現攝食與飲水量略有減少的現象，其中模型組小鼠毛色不光澤，行動略遲緩。除了空白組，給予其余各組小鼠52°白酒后，均出現不同程度的醉酒現象：反應遲鈍、流涎、四肢癱軟、步履不穩、嗜睡等，有部分小鼠出現前爪撓嘴的現象，甚至伴隨呼吸急促。在給予藥物后，陽性對照組和溪黃草組可逐漸恢復正常。

與空白組小鼠相比，各組小鼠體重顯著下降(P<0.05)，其中溪黃草組下降最為顯著(P<0.01)；模型組的肝臟重量略有增加，通過肝臟系數計算公式得出的，其肝臟指數顯著增加(P<0.05)，表明酒精造成的肝損傷會使得肝細胞腫大；與模型組相比，陽性對照和溪黃草組均顯著降低(P<0.05)，說明兩者藥物均可以緩解小鼠肝臟受損情況。結果見表1。

表1 溪黃草對小鼠體重、肝臟重量及肝臟指數的影響

3.2 肝臟形態的肉眼觀察 空白組的小鼠肝臟形態正常，肝色鮮紅，包膜光滑，濕潤，有彈性，且邊緣銳利(小框所示)、質韌，無病變現象；模型組的肝臟外觀主要表現為灰黃色點狀壞死灶，肝色暗沉，包膜略光滑，邊緣變鈍(小框所示)，質地變軟，易碎，切面略帶油膩感，說明酒精所致小鼠急性肝損傷造摸成功；與模型組比較，陽性對照組和溪黃草組的病變現像有所改善，肝色偏鮮紅，略濕潤，彈性增加，邊緣組織鈍化不明顯(小框所示)，而且兩組間外觀觀察，無明顯的區別，說明溪黃草對急性酒精性肝損傷有一定的改善作用。結果如圖2所示。

圖2 肉眼觀察小鼠肝臟組織的大體情況

3.3 溪黃草水提取物對肝臟、血清中肝功能指標的影響 與空白對照組比較，急性酒精性肝損傷小鼠肝臟、血清ALT、AST含量均顯著增加，提示造模成功；與模型組比較，陽性組和溪黃草組的ALT、AST含量顯著降低(P<0.01)，提示溪黃草水提物能改善急性肝損傷的肝功能指標水平。結果見表 2、3。

表2 溪黃草水提物對ALD小鼠肝臟組織的ALT、AST水平的影響

表3 溪黃草水提物對ALD小鼠血清的ALT、AST水平的影響

3.4 溪黃草水提物對ALD小鼠的抗氧化水平的影響 酒精會在人體的新陳代謝中產生大量的活性氧(ROS)，影響機體的抗氧化系統，導致酒精性肝損傷，而體內的抗氧化劑會保護細胞免受活性氧的影響，但這些抗氧化劑的活性很容易被過量的脂質過氧化物清除，導致肝臟損傷[9]。與空白組相比，模型組小鼠肝臟、血清中的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均顯著下降，而自由基作用于脂質過氧化的產物丙二醛(MDA)含量顯著上升(P<0.01)，這表明酒精引起小鼠肝臟中過氧化物水平的顯著增加，并且抗氧化能力下降，提示造模成功。陽性對照組、溪黃草組能夠顯著提高ALD小鼠肝臟、血清中GSH-px、SOD的活性(P<0.05)，不同程度地降低MDA的含量(P<0.05)，提示溪黃草水提物能促進GSH-px、SOD的活性，有效防止酒精攝入引起的小鼠肝細胞過度氧化，增強機體抗氧化能力，且能不同程度的降低MDA的含量。結果見表4、5。

表4 溪黃草水提物對ALD小鼠肝臟組織的SOD、GSH-px、MDA水平的影響

表5 溪黃草水提物對ALD小鼠血清的SOD、GSH-px、MDA水平的影響

4 討論

經胃腸道吸收的酒精90%～98%在肝臟中通過乙醇脫氫酶途徑、微粒體乙醇氧化系統、過氧化氫酶系統這3個途徑進行代謝。在這氧化代謝過程中，產生的大量自由基介導了肝細胞內氧化應激反應，增加了體內的氧化水平，當肝細胞中的氧化水平超過抗氧化水平時，就會破壞肝臟的細胞膜脂質導致肝細胞壞死[10]。ALT、AST是肝細胞損傷的標志，肝細胞損傷時，細胞膜破壞，細胞通透性增加，使肝細胞中的 ALT 與AST進入血液進而引起血清中ALT 與AST的升高[11]。機體內存在包括 SOD 等酶類及包括還原型谷胱甘肽(GSH-px)等非酶類兩大抗氧化防御體系，以清除氧自由基，阻斷組織過氧化損傷；MDA 是活性氧自由基氧化生物膜過程中產生的脂質過氧化產物，其水平的高低與氧化應激對肝臟的損害程度相關[12-13]。溪黃草唇含有二萜類、黃酮類等重要的有效成分，而二萜類化合物經過藥理篩選證實其具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗炎等多種生物活性，其作用機制與肝臟線粒體的保護、肝臟內源性抗氧化系統的調控相關；黃酮類物質具有抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物等藥理活性，對肝臟損傷有較好的保護作用[14-15]。

本實驗對溪黃草水提物進行了保肝作用及機制的研究，結果初步顯示，與空白組比較，模型小鼠體肝臟明顯腫大，血清ALT、AST 水平增加，肝指數增大，肝組織MDA含量顯著增加，SOD、GSH-px 活性顯著降低，提示模型小鼠肝功能受損且可能存在脂質過氧化反應，同時也說明造模成功。給予溪黃草水提物進行干預，能有效拮抗模型小鼠肝臟質量增加，降低肝組織 MDA 水平，提高 SOD、GSH-px 活性，改善肝腫大；肝組織外觀觀察顯示，溪黃草水提物組小鼠肝臟受損情況改善明顯，可減輕肝臟病變狀態，逐漸恢復接近陽性對照組的肝臟情況。而且溪黃草組小鼠體重顯著減少，由此可以推測溪黃草通過調節機體氧化酶系統影響了脂肪代謝途徑，這可能是預防急性肝損誘發脂肪肝的保護機制。因此認為溪黃草能抑制肝功能指標水平的上升、保護肝細胞以及有效改善肝功能，為防治急性酒精性肝損傷的作用機制之一[16-18]。此外，本實驗結果也證實溪黃草水提物可增強GSH-px、SOD活性并阻止酒精引起的MDA升高，從而降低氧化應激所引起的肝細胞損傷，結果提示，抗氧化作用可能是溪黃草水提物對ALD小鼠急性肝損傷的保護作用機制之一。

綜上，溪黃草水提物護肝機制主要是通過降低機體的氧化應激反應，抑制肝功能指標水平的增加，改善肝臟病變情況，也將為深入研究其保肝通路機制奠定實驗基礎。