二黃益腎湯質量標準的建立

李冬冬 田雪芬 王 靜 周 瑋 張丹丹

山東省濟寧市中醫院，山東 濟寧 272037

二黃益腎湯是我院腎病科老中醫以中醫藥理論為指導，結合多年的臨床經驗，總結出的經驗方，是由丹參、黃芪、大黃、炒白術、炙淫羊藿、莪術、砂仁、石葦等10味中藥采用傳統工藝結合現代技術制成的口服液體劑型，具有補腎健脾、活血通絡、清熱泄濁之功效，可降低內生肌酐和尿素氮水平，臨床上主要用于氣虛濕瘀型慢性腎功能不全的治療。該方療效顯著，不良反應小，使用安全，深受廣大患者的好評。方中大黃為君藥，性苦、寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經之功效。現代藥理學研究表明，大黃素能明顯減輕單側輸尿管結扎腎間質纖維化模型大鼠腎組織病理學損傷程度，且大鼠腎組織PDGF-B表達明顯減少，說明大黃素能夠減緩腎組織纖維化進程，具有腎臟保護作用[1]；大黃酸可抑制TGF-β1誘導的HBZY-1大鼠腎小球系膜細胞的增殖，可以降低血清肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白水平[2]。

二黃益腎湯現行標準只有【性狀】及【檢查】項，無【鑒別】與【含量測定】項，現行標準不完善。為有效控制本制劑的質量，完善質量控制標準，保障臨床用藥的安全、有效，故對丹參和黃芪采用TLC進行定性鑒別，對大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚采用RP-HPLC進行定量測定，本研究從TLC和RP-HPLC兩方面入手，建立該產品的質量控制標準。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；AB135-S型十萬級電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；ZF-8暗箱三用紫外分析儀(上海一科儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹參對照藥材(批號120923-201615)；黃芪對照藥材(批號120974-201612)；大黃酸(純度≥99%，批號110757-201607)；大黃素(純度≥98%，批號110756-201512)；大黃酚(純度≥99%，批號110796-201621)；黃芪甲苷(純度≥97%，批號110781-201717)均來自于中國食品藥品檢定研究院。

二黃益腎湯(規格：每瓶150 mL，濟寧市中醫院制劑室制，批號：20181014、20181129、20181227)。

甲醇(色譜純，Avantor Performance Materials, Inc., USA; GC≥99.9%)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[3]

2.1.1 丹參[4]取本品(批號20181014)20 mL，加10%稀鹽酸調pH至2.0，再用乙酸乙酯振搖提取2次，每次50 mL，合并兩次提取液，揮干乙酸乙酯，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得供試品溶液。取除丹參以外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對照溶液。再取丹參對照藥材0.6 g，加水100 mL，加熱回流1.5 h，濾過，濾液濃縮至約20 mL，放冷，按供試品的制備方法處理，即得對照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，依次吸取對照藥材溶液5 μL、供試品溶液8 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴3%三氯化鐵乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾。如圖1所示。

2.1.2 黃芪[5-7]取本品(批號20181014)25 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次(首次輕輕振搖)，每次40 mL，合并提取液，用氨液洗滌 2 次(50 mL、30 mL)，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次30 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得供試品溶液。取除黃芪外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成不含黃芪的溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對照溶液。取黃芪對照藥材2.0 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約20 mL，同法即得對照藥材溶液。再取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成l mg·mL-1的溶液，即得對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取對照品溶液和對照藥材溶液各4 μL、供試品溶液8 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置超過6 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點，相應位置處陰性對照無斑點。如圖2所示。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品混合儲備液的制備 分別精密稱取大黃素對照品、大黃酸對照品和大黃酚對照品各2.13、6.66和2.22 mg，分別置于5 mL、1 mL和2 mL量瓶中，用甲醇至刻度，搖勻，各吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得0.0426 mg·mL-1大黃素對照品、0.666 mg·mL-1大黃酸對照品和0.111 mg·mL-1大黃酚對照品混合儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備[3,8-10]精密量取樣品(批號20181129)50 mL，置燒瓶中，加8%鹽酸100 mL，超聲處理3 min，再加三氯甲烷150 mL，水浴回流40 min，放冷，三氯甲烷層置分液漏斗中，再用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，上層酸液再用150 mL三氯甲烷水浴回流一次(20 min)，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次100 mL，合并提取液，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件[11-13]Purospher star RP-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇-0.1%磷酸溶液(70∶30)為流動相；檢測波長為255 nm；柱溫為25 ℃；流速1.0 mL·min-1。

2.2.4 線性關系考察 精密量取2.2.1項下的對照品混合儲備液，用甲醇逐級稀釋成41.625、83.25、166.5、333.0、499.5、666.0 μg·mL-1的大黃酸對照品和2.663、5.325、10.65、21.3、31.95、42.6 μg·mL-1的大黃素對照品以及6.94、13.88、27.75、55.5、83.25、111.0 μg·mL-1的大黃酚對照品混合溶液，不同濃度的對照品混合溶液各進樣8 μL，按2.2.3項下色譜條件進行測定，記錄對應峰面積。以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得大黃酸的回歸方程為Y=6472.816X-5364.543，r=1.000 0，線性范圍為41.625～666.0 μg·mL-1；大黃素的回歸方程為Y=27439.750X-26299.681，r=0.999 9，線性范圍為2.663～42.6 μg·mL-1；大黃酚的回歸方程為Y=13646.903X-23053.364，r=0.999 9，線性范圍為6.94～111.0 μg·mL-1。

2.2.5. 方法學驗證[14-15]

2.2.5.1 精密度試驗 取2.2.1項下對照品混合儲備液6 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積，計算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為1.36%、1.08%和1.44%。結果表明，儀器精密度較好。

2.2.5.2 穩定性試驗 取2.2.2項下供試品溶液5 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項下色譜條件操作，分別于0、4、8、12、16、24 h間隔下進樣，記錄峰面積，計算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.26%、2.98%和2.89%。由結果可知，供試品中的3種化合物在24 h內穩定。

2.2.5.3 重復性試驗 取同一批號樣品(批號20181129)，按2.2.2項下方法制成6份供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件操作，均進樣1次，記錄峰面積，計算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.29%、2.06%和2.18%。由結果可知，方法重復性良好。

2.2.5.4 加樣回收率試驗 平行取6份已知含量的同一批號樣品(批號20181129)各50 mL，分別加入含量相當量80%、100%、120%的大黃酸、大黃素和大黃酚混合對照品，按2.2.2項下的方法制備成溶液，每次進樣5 μL，結果見表1。大黃酸平均回收率為97.45%，RSD為0.39%；大黃素平均回收率為98.63%，RSD為1.18%；大黃酚平均回收率為98.15%，RSD為0.89%。

表1 回收率試驗結果 (n=6)

續表1 表1 回收率試驗結果 (n=6)

2.2.6 專屬性 按處方和工藝制成不含大黃的陰性對照樣品，再按2.2.2項下方法制成陰性對照溶液。標準品混合儲備液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL進樣，按上述色譜條件進行測定。混合標準品、供試品和陰性對照的HPLC圖如圖3所示。

2.2.7 定量限、檢測限 取對照品溶液逐級稀釋，取信噪比S/N為10的作為定量限，大黃酸、大黃素和大黃酚的定量限分別為4.386、5.532、9.470 ng；取信噪比S/N為3的作為檢測限，分別為2.525、4.056、6.061 ng。

2.2.8 樣品含量測定 取3批樣品，按2.2.2項下方法平行制備兩份，分別測定，計算二黃益腎湯樣品中大黃酸、大黃素和大黃酚含量，結果見表2。

表2 二黃益腎湯中大黃酸、大黃素和大黃酚含量測定結果 (mg·mL-1，n=3)

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 二黃益腎湯主要是由大黃、丹參、黃芪、炙淫羊藿、炒白術、莪術等10味中藥組成，其中大黃為君藥，丹參、黃芪等為臣藥，現行標準無薄層鑒別項，因此定性鑒別選擇方中的臣藥加以研究。

黃芪的薄層鑒別中，樣品用水飽和的正丁醇提取后再用氨水洗滌，薄層展開時發現雜質較多，斑點相互有干擾，因此樣品處理時最后添加了正丁醇飽和的水洗滌這一步驟，可以除去樣品中極性較小的雜質；用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑進行鑒別時，發現10 ℃以下放置超過6 h的展開劑能有效降低斑點的拖尾，可以得到較好的展開效果。

3.2 含量測定 大黃作為方中的君藥，具有降低尿素氮、保護殘存腎功能、延緩腎纖維化等作用，其有效成分主要以蒽醌類為主，分為結合蒽醌和游離蒽醌，游離蒽醌的成分有大黃素、大黃酸和大黃酚等，這些都是大黃發揮藥效的活性物質[16]。大黃在提取過程中，游離蒽醌的損失量遠高于結合蒽醌，導致游離蒽醌在溶液中的含量很低；另外，游離蒽醌在口服后，易在上消化道部位吸收[17]，最終到達大腸的量極有限，因此本試驗對總蒽醌進行定量測定。

樣品處理時，參考2015版《中華人民共和國藥典》大黃含量測定中總蒽醌的處理方法，先用8%鹽酸進行酸水解，再用三氯甲烷萃取。但封淑華等[18]報道酸水解時酸的濃度對大黃酸有較大影響，對其他物質影響極小，因此本試驗中酸的濃度直接采用2015版《中華人民共和國藥典》大黃供試品溶液的制備方法。

參考文獻[11-12,19]，流動相先后嘗試了甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30、76∶24、80∶20、85∶15等多種洗脫程序，其中76∶24時大黃酸主峰與其前面的雜質峰連在一起，隨著甲醇比例的提高，大黃酸主峰與雜質峰近乎無法分離開。之后將甲醇的比例在70%左右調節，綜合比較其分離度、拖尾因子、峰面積和經濟性等指標，最終選定甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30作為本試驗的流動相系統。

本試驗使用二極管陣列檢測器(PDA)進行全波長掃描(190～800 nm)，結果發現大黃樣品在255 nm處3個成分具有較大的吸收，且雜質成分干擾少，故以255 nm作為大黃的檢測波長。

4 結論

本研究建立的質量控制方法，經過對多批產品的驗證，結果表明薄層色譜法中斑點分離效果好，陰性溶液對樣品的定性鑒別無干擾，方法的專屬性較強。含量測定試驗，具有良好的重復性，加樣回收率高，定量結果準確可靠。增加的薄層色譜鑒別和含量測定項，能有效控制二黃益腎湯的質量，對二黃益腎湯質量標準的制定有一定提高作用。