歐亞旋覆花總黃酮對衰老人皮膚成纖維細(xì)胞lncRNA TERRA的影響及其機制

周茂強，況杰，胡翰林，果磊

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形燒傷外科，重慶 400016

衰老是在遺傳和環(huán)境的共同影響下發(fā)生的全方位、多因素、系統(tǒng)的不可逆轉(zhuǎn)的過程，常伴隨機體應(yīng)激能力衰退和結(jié)構(gòu)退行性變[1]。目前發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA[2]，主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后等水平的基因表達(dá)模式，在衰老及相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。 某些特定的lncRNAs可通過激活MAPK通路抑制細(xì)胞凋亡，從而延緩衰老進程[4]。端粒是真核細(xì)胞染色體末端特殊的異染色質(zhì)核蛋白復(fù)合物[5]，可隨著細(xì)胞的分裂而縮短，對維持染色體完整性和細(xì)胞穩(wěn)定性至關(guān)重要，其縮短可導(dǎo)致細(xì)胞衰老[6]。非編碼端粒重復(fù)RNA(telomeric repeat containing RNA，TERせ)是由RNA PolⅡ?qū)⒍肆膩喍肆^(qū)域轉(zhuǎn)錄而成，可以一種長度依賴的方式調(diào)節(jié)單個染色體末端的端粒酶活性，甚至可能參與短端粒的DNA損傷反應(yīng)，具有引發(fā)早期衰老和端粒重組的獨特功能[7]。目前，從天然植物和傳統(tǒng)草藥中研究開發(fā)新型的抗衰老產(chǎn)品成為全球熱點[8]。有研究認(rèn)為，中藥的抗衰老效應(yīng)與其促進端粒穩(wěn)定有關(guān)，主要機制包括抗氧化[9]、 激活端粒酶活性[10]、抑制相關(guān)基因(如p16)的功能[11]等。歐亞旋覆花總黃酮(Inula britannica flower total flavonoids，IBFTF)是從歐亞旋覆花中提取的天然抗衰老藥物，具有抗炎、抗氧化等功效[12-13]， 但其抗衰老的具體機制尚不清楚，是否與調(diào)控端粒穩(wěn)定有關(guān)尚需進一步研究。本研究擬在D-半乳糖(D-galactose，D-gal)誘導(dǎo)建立的衰老人皮膚成纖維細(xì)胞模型中，探討IBFTF對lncRNA TERRA表達(dá)的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 D-gal(美國Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國康寧CellGro公司)；FBS Premium優(yōu)等胎牛血清(德國PAN公司)；RNAiso Plus試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及熒光實時定量PCR反應(yīng)試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物構(gòu)建于日本TaKaRa公司；兔抗端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔抗p53抗體(7F5；美國Cell Signaling Technology公司)；兔抗p16-INK4A抗體、兔抗β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、丙二醛(malonaldehyde，MDA)測定試劑盒(TBA法；沈陽萬類生物科技有限公司)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒、β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒、BCA蛋白濃度測試盒(增強型；江蘇碧云天生物公司)；Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(CCK-8試劑盒；武漢博士德生物工程有限公司)；甲醇、乙腈(HPLC級；美國Honeywell公司)；槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁(純度≥98%；上海源葉生物科技有限公司)。PCR擴增儀、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；RIGOL L3000高效液相色譜儀(北京普源精儀科技有限責(zé)任公司)；Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；瑞典NOBEL公司)。

1.2 IBFTF制備 歐亞旋覆花購自重慶市中醫(yī)藥材專業(yè)市場(產(chǎn)地為中國江蘇)，由重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院曹緯國教授認(rèn)證。歐亞旋覆花加水煮沸1 h，紗布過濾，減壓濃縮制成濃縮液(濃度20 g/L)，AB-8大孔樹脂柱富集吸附，70%乙醇洗滌，上樣流速0.12 L/h。采用分光光度法，以蘆丁作為參照標(biāo)準(zhǔn)，測得提取物中總黃酮含量為82.6%。

1.3 HPLC分析IBFTF的成分及含量

1.3.1 對照品、供試品溶液制備 稱取槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁對照品各10 mg，分別用甲醇溶解、10 ml容量瓶定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得到對照品溶液。

稱取0.01 g IBFTF樣品粉末，研磨，加入甲醇與25%鹽酸水溶液(V:V=4:1)的混合液1.5 ml研磨勻漿，80 ℃水浴水解1.5 h，超聲提取30 min，10 000×g離心10 min，取上清，用針頭式過濾器過濾，即得到供試品溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系分析 取對照品溶液6份，用70%甲醇稀釋成濃度1、5、10、50、100、200 mg/L，各取1 ml進樣測定，記錄峰面積，分析對照品濃度(x)與峰面積(y)的線性關(guān)系。色譜條件如表1所示。

1.3.3 精密度試驗 取供試品溶液1份，連續(xù)進樣6次，測定槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。色譜條件如表1所示。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗 按照1.3.1方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12及24 h進樣測定，記錄峰面積，計算槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁峰面積的RSD，評估供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。色譜條件如表1所示。

1.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批IBFTF樣品粉末6份，按照1.3.1方法制備供試品溶液，進樣測定，計算槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁含量的RSD，評估提取方法的重復(fù)性。色譜條件如表1所示。

1.3.6 加樣回收率測定 精密稱取已知各成分含量的同一批IBFTF樣品粉末6份，每份0.1 g，添加對照品溶液1 ml，按照1.3.1方法制備供試品溶液，進樣測定，計算槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁的平均回收率及RSD。色譜條件如表1所示。

1.3.7 樣品含量測定 測定3批不同時間提取的樣品中槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁的含量，按照1.3.1方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算各成分含量。色譜條件如表1所示。

表1 HPLC色譜條件Tab.1 The chromatographic conditions of HPLC

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及衰老細(xì)胞模型建立 人皮膚成纖維細(xì)胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司。人皮膚成纖維細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時傳代。傳代細(xì)胞融合度達(dá)50%時，使用10 g/L D-gal誘導(dǎo)72 h，制備衰老細(xì)胞模型[14]。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞200 μl，接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1000個/孔，使用10 g/L D-gal誘導(dǎo)72 h，制備衰老細(xì)胞模型。使用不同濃度的IBFTF(10、20、30、40、50 mg/L)作用細(xì)胞24 h；對照孔不加IBFTF，空白孔加入200 μl培養(yǎng)基，均設(shè)5個復(fù)孔。換液，每孔加入200 μl培養(yǎng)基+20 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔吸光度(OD)值，計算細(xì)胞存活率，確定IBFTF的最佳作用濃度。

同上述方法，用96孔板接種細(xì)胞并制備衰老細(xì)胞模型，使用最佳濃度的IBFTF作用細(xì)胞12、24、36、48 h，如上法加入CCK-8溶液，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔OD值，計算細(xì)胞存活率，確定IBFTF的最佳作用時間。

1.6 細(xì)胞分組與衰老特異性SA-β-Gal染色

1.6.1 細(xì)胞分組 將細(xì)胞分為對照組、IBFTF組、衰老模型組、衰老模型+IBFTF組。IBFTF組細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，加入IBFTF處理；衰老模型組細(xì)胞融合度達(dá)50%時，加入D-gal 10 g/L誘導(dǎo)72 h；衰老模型+IBFTF組細(xì)胞融合度達(dá)50%時，使用10 g/L D-gal誘導(dǎo)72 h，然后加入IBFTF處理。對照組細(xì)胞無D-gal誘導(dǎo)，無IBFTF處理。IBFTF處理均選用最佳作用濃度及最佳作用時間。

1.6.2 SA-β-Gal染色 取融合度為80%的細(xì)胞，以2×104個/孔的密度接種到6孔板中，每組1個孔，并按上述細(xì)胞分組方法處理，行SA-β-Gal染色，具體操作參照SA-β-Gal細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒說明書，37 ℃、無CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，各孔隨機選取5個視野，計數(shù)藍(lán)染細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞比例，取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.7 SOD、GSH-Px活性以及MDA含量測定 人皮膚成纖維細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，分組及處理方法如上述，胰酶消化后，1000×g離心5 min，收集各組細(xì)胞，冰浴下超聲破碎為細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說明書步驟，使用酶標(biāo)儀測定550 nm、340 nm、532 nm處各組的OD值，計算SOD、GSHPx活性以及MDA含量。

1.8 實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測lncRNA TERRA、Telomere、hTERT mRNA的表達(dá) 各組細(xì)胞接種于6孔板中，接種及處理方法同1.5，使用Trizol提取總RNA，根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄說明書步驟合成相應(yīng)cDNA并擴增，以β-actin為內(nèi)參，分析lncRNA TERRA、hTERT mRNA的表達(dá)情況，以及端粒的長度。反應(yīng)總體系10 μl(TB Green 5 μl、DEPC水3.2 μl、正反引物各0.4 μl、cDNA 1 μl)，每個樣本3個復(fù)孔。擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA TERRA、Telomere、hTERT mRNA的相對表達(dá)量。引物序列如表2所示。

表2 細(xì)胞周期相關(guān)基因PCR引物序列Tab.2 The primers sequence of cell cycle-related genes

1.9 Western blotting檢測hTERT、p53、p16蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞使用RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA法測定裂解上清的蛋白濃度，然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃搖床過夜，加入一抗β-actin(1:3000)、p53(1:1000)、p16(1:500)、TERT(1:500)，TBST洗膜，加入二抗(1:8000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，顯影，使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad 7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)作圖。每個實驗重復(fù)3次。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IBFTF成分及含量分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系分析結(jié)果顯示，蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素4種成分的對照品濃度(x)與峰面積(y)的線性關(guān)系良好(R2均＞0.95，表3)。

表3 IBFTF對照品的線性方程及其濃度范圍Tab.3 Linear equations of IBFTF reference substances and their concentration range

圖1 IBFTF對照品和供試品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of IBFTF reference and test samples

精密度試驗結(jié)果顯示，槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁峰面積的RSD分別為0.75%、0.12%、0.34%、0.52%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁峰面積的RSD分別為0.80%、1.12%、1.03%、0.97%，表明供試品溶液在24h內(nèi)較穩(wěn)定。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁含量的RSD分別為1.47%、0.77%、1.32%、1.20%，表明提取方法重復(fù)性良好。加樣回收率測定結(jié)果顯示，槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁的回收率分別為98.56%、98.32%、97.87%、97.23%，RSD分別為0.74%、1.15%、1.28%、0.97%，表明加樣回收率較高。樣品含量測定結(jié)果顯示，3批不同時間提取的樣品中槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁的含量為6.447、2.044、1.272、0.781 mg/g(表4)，對照品和供試品的HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 IBFTF的最佳作用濃度及最佳作用時間 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的IBFTF作用于細(xì)胞后，與對照組相比，實驗組(10、20、30、40、50 mg/L)細(xì)胞存活率均升高，當(dāng)IBFTF濃度為30 mg/L時，細(xì)胞存活率最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=330.021，P=0.000)。以30 mg/L IBFTF作用細(xì)胞，與對照組相比，實驗組(12、24、36、48 h)細(xì)胞存活率均升高，并于24 h達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=76.722，P=0.000，圖2)。后續(xù)實驗采用IBFTF最佳作用濃度30 mg/L、最佳作用時間24 h處理細(xì)胞。

表4 3批不同時間提取的IBFTF成分含量測定結(jié)果(mg/g)Tab.4 Contents of IBFTF in 4 materials extracted in 3 batches (mg/g)

圖2 IBFTF對衰老人皮膚纖維細(xì)胞存活率的影響(CCK-8法)Fig.2 Effect of IBFTF on the survival rate of fibrocytes in the senescent skin (by CCK-8)

2.3 IBFTF對各組細(xì)胞衰老特異性SA-β-Gal活性的影響 SA-β-Gal染色結(jié)果顯示，與對照組比較，衰老模型組SA-β-Gal陽性細(xì)胞比例明顯升高(P=0.000)；IBFTF組與對照組SA-β-Gal陽性細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.676)。與衰老模型組比較，衰老模型+IBFTF組SA-β-Gal陽性細(xì)胞比例明顯降低(P=0.000，圖3)。

圖3 IBFTF對各組細(xì)胞衰老特異性SA-β-Gal活性的影響Fig.3 Effect of IBFTF on the senescence-associated β-galactosidase in each group

2.4 IBFTF對各組細(xì)胞SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響 酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，衰老模型組SOD、GSH-Px活性明顯降低(P=0.000，P=0.002)，MDA含量明顯升高(P=0.000)，表明D-gal誘導(dǎo)成功建立了衰老模型，降低了細(xì)胞的抗氧化防御能力。與衰老模型組比較，衰老模型+IBFTF組SOD、GSH-Px活性明顯升高(P=0.000，P=0.001)，MDA含量明顯降低(P=0.000)。IBFTF組與對照組SOD、GSH-Px活性以及MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.052，P=0.066，P=0.142，圖4)。

2.5 IBFTF對各組細(xì)胞lncRNA TERRA、Telomere、hTERT mRNA表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，衰老模型組lncRNA TERRA的表達(dá)水平明顯升高(P=0.000)，Telomere、hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P=0.000，P=0.000)；IBFTF組與對照組lncRNA TERRA、Telomere、hTERT mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.766，P=0.205，P=0.055)。與衰老模型組比較，衰老模型+IBFTF組lncRNA TERRA的表達(dá)水平明顯降低(P=0.000)，Telomere、hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P=0.000，P=0.001，圖5)。

圖4 IBFTF對各組細(xì)胞SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響Fig.4 Effect of IBFTF on the activities of SOD, GSH-Px and MDA content

2.6 IBFTF對各組細(xì)胞hTERT、p53、p16蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，衰老模型組hTERT蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，p53、p16蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)；與衰老模型組比較，衰老模型+IBFTF組hTERT蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)，p53、p16蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01，圖6)。

圖6 IBFTF對各組細(xì)胞hTERT、p53、p16蛋白表達(dá)的影響(Western blotting)Fig.6 Effect of IBFTF on the expressions of hTERT, p53 and p16 protein in each group (Western blotting)

3 討 論

在機體衰老生物學(xué)特性研究中，通常采用誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老的方法來構(gòu)建衰老細(xì)胞模型[15]。IBFTF作為天然抗衰老藥物，具有極強的抗氧化、抗衰老功效[12]。本研究依據(jù)文獻[16-17]選擇4種功效成分即槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁，建立了HPLC分析方法，該方法經(jīng)過方法學(xué)考察，重復(fù)性與穩(wěn)定性良好，回收率高，可作為IBFTF的成分定量方法。本研究以不同濃度的IBFTF作用于D-gal誘導(dǎo)的衰老成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IBFTF可明顯提高衰老細(xì)胞的存活率，通過CCK-8法檢測明確了IBFTF的最佳作用濃度和最佳作用時間為30 mg/L和24 h。

細(xì)胞衰老是一種不可逆轉(zhuǎn)的阻滯增殖狀態(tài)，衰老細(xì)胞在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出特征性的表型和分子特征，衰老特異性的SA-β-Gal和氧化應(yīng)激生化指標(biāo)目前常用于衰老特征檢測[18-19]。本研究使用D-gal誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞建立衰老模型，發(fā)現(xiàn)其SAβ-Gal陽性細(xì)胞比例較對照組明顯升高，用IBFTF處理后，SA-β-Gal陽性細(xì)胞比例較衰老模型組下降，表明IBFTF可降低成纖維細(xì)胞SA-β-Gal的活性。衰老細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生聚集大量活性氧(ROS)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激而引起細(xì)胞損傷，而MDA、SOD和GSH-Px為常用的氧化應(yīng)激生化指標(biāo)[19]。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，可反映過量ROS引起的細(xì)胞損傷程度；SOD可抑制MDA及自由基代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，清除細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基，減緩機體的衰老；GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑[20]。本研究中IBFTF可恢復(fù)衰老模型組細(xì)胞中SOD、GSH-Px的活性，顯著降低MDA含量。

p53和p16是目前最常用的衰老標(biāo)志物[21]。p53通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制因子p21的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯[22]。Liu等[23]發(fā)現(xiàn)，p16在衰老細(xì)胞中表達(dá)增加，而在正常或永生化的人類細(xì)胞中過表達(dá)會導(dǎo)致衰老。本研究中，在D-gal的誘導(dǎo)下，p53和p16蛋白的表達(dá)較對照組明顯上調(diào)，加用IBFTF后，p53和p16的蛋白表達(dá)較衰老模型組明顯下調(diào)，表明D-gal成功誘導(dǎo)建立了人成纖維細(xì)胞衰老模型，而IBFTF可通過降低SA-β-Gal活性、減弱細(xì)胞氧化應(yīng)激來達(dá)到延緩衰老的目的。

LncRNA TERRA是一種長鏈非編碼RNA，近年來研究發(fā)現(xiàn)，TERRA異常表達(dá)可抑制成纖維細(xì)胞端粒延長而出現(xiàn)衰老[24]。Feuerhahn等[25]發(fā)現(xiàn)，TERRA水平升高可導(dǎo)致衰老相關(guān)疾病的發(fā)生，而抑制TERRA的表達(dá)可通過延長成纖維細(xì)胞端粒長度，進而抑制細(xì)胞衰老。本研究通過qRT-PCR驗證了在D-gal誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞模型中TERRA呈高表達(dá)，而IBFTF可使TERRA的表達(dá)水平降低。由此推測TERRA表達(dá)水平的升高與端粒及端粒酶功能障礙 有關(guān)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，端粒及端粒酶在衰老機制中起著關(guān)鍵作用[26]。端粒酶作為一種核糖核酸反轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA合成為染色體末端。端粒酶的核心成分為其催化亞基——人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)，而hTERT mRNA的表達(dá)對端粒酶的活性和端粒長度穩(wěn)態(tài)起決定性作用[27-28]。端粒酶重新激活被認(rèn)為是延緩細(xì)胞衰老的主要機制，端粒長度的動態(tài)平衡是由端粒長度依賴于染色體末端端粒酶的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的[29]。LncRNA TERRA可抑制端粒延長，因其與TERRA轉(zhuǎn)錄本中存在大量的端粒UUAGGG重復(fù)拷貝有關(guān)，重復(fù)跨度約為200 nt[30]，致使TERRA成為端粒酶的高親和力配體，從而成為競爭性抑制劑，對RNA模板和hTERT多肽起到抑制作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞發(fā)生衰老時，端粒長度縮短，hTERT mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，而IBFTF可下調(diào)TERRA的表達(dá)，使細(xì)胞通過恢復(fù)端粒酶的活性而補充端粒序列，從而達(dá)到延長端粒、延緩衰老的目的。

筆者認(rèn)為，同既往其他抗衰老藥物的研究結(jié)果類似，抗衰老藥物或干預(yù)措施(如IBFTF)對衰老細(xì)胞的衰老有抑制作用，而對正常細(xì)胞作用不明顯。分析原因如下：①本研究qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，lncRNA TERRA、端粒及端粒酶在衰老細(xì)胞與正常細(xì)胞中存在顯著的差異性表達(dá)，由此推測，lncRNA TERRA及端粒是細(xì)胞衰老的重要調(diào)節(jié)機制；②加入IBFTF后，衰老細(xì)胞的SA-β-Gal、SOD、GSH-Px活性，MDA含量，以及p53、p16蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化，而正常細(xì)胞無明顯變化；同時加入IBFTF后，衰老細(xì)胞的lncRNA TERRA、端粒及端粒酶也有明顯變化，而正常細(xì)胞無明顯變化，因此lncRNA TERRA、端粒及端粒酶可能是IBFTF抑制人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的重要機制，且這種抗衰老作用對衰老細(xì)胞的影響更明顯；③上述結(jié)果及結(jié)論與既往相關(guān)研究結(jié)果類似，如Min等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芩苷對衰老的皮膚成纖維細(xì)胞具有明顯的抗衰老作用，但對正常皮膚細(xì)胞的作用不明顯。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，IBFTF可降低D-gal誘導(dǎo)的衰老人成纖維細(xì)胞lncRNA TERRA的表達(dá)，發(fā)揮抗衰老作用，其機制可能與恢復(fù)端粒酶活性、延長端粒長度有關(guān)，該結(jié)果為IBFTF的臨床推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。