環狀RNA在椎間盤退變中的作用機制及臨床價值

張凱，施錦濤，張曉勃，王克平，周海宇,*

1蘭州大學第二醫院骨科，蘭州 730030；2甘肅省骨與關節疾病研究重點實驗室，蘭州 730030；3蘭州市西固區人民醫院骨科，蘭州 730060

腰背痛是骨關節疾病最常見的癥狀之一，與椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)密切相關[1]。據統計，有75%～80%的人群在生活中經歷過這種疼痛[2]。IDD導致的病理改變主要包括髓核(nucleus pulposus，NP)細胞凋亡和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)分解，而目前的治療以緩解癥狀為主，并不能逆轉IDD的病理改變。最新研究發現，環狀RNA(circular RNAs，circRNAs)作為內源性競爭RNA能夠自發地與微小RNA(microRNA，miRNA)結合，調控IDD相關基因的表達，通過影響髓核細胞凋亡、ECM穩態，誘導促炎因子表達及調節壓力負荷等方式參與IDD的病理過程[3]。本文對近年來circRNAs在IDD發病機制中的研究進展進行綜述，旨在為IDD的診斷和治療提供參考。

1 CircRNA概況

CircRNA是一種普遍存在于真核生物中的新型非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，是由單鏈線性RNA的首尾端以3'，5'-磷酸二酯鍵形成的閉合環狀分子[4]。1976年，Sanger等[5]在研究類病毒RNA時發現了一種無蛋白外殼包裹的單鏈閉合環狀RNA，首次證實了circRNAs的存在。但受限于當時的研究技術及檢測水平，其發現并未引起研究者的廣泛關注。隨著高通量測序和生物信息學技術的廣泛應用，越來越多的circRNAs相繼被發現和報道[6-9]，其生物學功能相關研究也更加深入。

CircRNAs由來源于外顯子和(或)內含子的核酸片段組成，根據來源不同可分為外顯子circRNA (ecRNA)、內含子circRNA(ciRNA)和外顯子-內含子circRNA(EIciRNA)。這些核酸片段通過不同的排列組合組成了數量龐大的circRNAs庫，目前人體中明確存在的circRNAs至少在14萬種以上[10]，研究其功能對人們了解疾病的發展進程起著至關重要的作用。根據目前的研究結果，可將其生物學功能總結為以下幾方面：①作為內源性競爭RNA(ceRNA)。CircRNAs具有大量的miRNA應答元件(miRNA response element，MRE)，能夠競爭性結合miRNA，繼而抑制miRNA發揮其生物學功能，如circCCDC9能結合miR-6792-3p并抑制miRNA對靶基因CAV1的調控作用，繼而延緩胃癌的發展[11]。②調控基因轉錄。CircRNAs能與mRNA結合并參與mRNA的轉錄調控，如circ_406961可與白細胞介素增強結合因子2(ILF2)相互作用，影響其對轉錄激活因子3(STAT3)和絲裂源蛋白激酶8(MAPK8)的磷酸化[12]。③與蛋白產生交互作用。如circPABPN1可與RNA結合蛋白HuR結合，抑制后者與核多聚腺苷酸結合蛋白(PABPN1)mRNA的結合，降低PABPN1翻譯的效率[13]。④直接翻譯合成蛋白質。CircRNAs可像mRNA一樣作為模板并指導蛋白質的合成，如circSHPRH可以編碼一種新肽SHPRH-146aa，能防止SNF2組蛋白連接子PHD環解旋酶(SHPRH)被E3連接酶降解[14]。除上述主要生物學功能外，circRNAs還可通過調控細胞間信號傳遞、調節細胞分化、充當蛋白質支架等[15-16]方式參與疾病的發生發展。

2 CircRNAs與椎間盤退行性疾病

椎間盤退行性疾病(intervertebral disc degeneration disease，DDD)是一種以IDD為特征性改變的脊柱關節疾病，也是臨床上引起腰背痛的主要原因。正常的椎間盤由中心的髓核、外層的纖維環和上下軟骨終板組成，其中髓核是維持椎間盤功能的主要部分，可通過產生ECM、分泌促炎因子、緩沖壓力負荷等方式保持椎間盤的完整性[17]。目前引起IDD的確切病因仍不清楚，可能與髓核細胞凋亡、ECM代謝失衡、炎性因子增多、壓力負荷過度和軟骨終板變性等多種因素相關[18]。隨著測序技術和生物信息學的廣泛應用，越來越多的研究發現circRNAs參與調控IDD相關基因的表達，可通過影響髓核細胞凋亡、破壞ECM穩態、誘導促炎因子表達等方式調節IDD的病理過程。

3 CircRNAs在IDD中的作用

3.1 CircRNAs與髓核細胞凋亡 凋亡是機體為維持內環境穩態而自主控制的程序性細胞死亡過程，正常椎間盤的增殖和凋亡保持相對穩定，但年齡增長、過度的壓力負荷及炎癥反應等因素都會引起髓核細胞過度凋亡，使椎間盤的正常結構難以維持，加速其退變過程，所以維持髓核細胞數量穩定在椎間盤退變過程中至關重要。Guo等[19]通過生物信息學分析發現circGRB10與miR-328-5p之間存在負向調控關系；應用RT-qPCR技術對比40對樣本中circGRB10和miR-328-5p的表達水平發現，退變的髓核細胞中circGRB10表達下降而miR-328-5p表達上升。隨后，通過實驗驗證了circGRB10可結合miR-328-5p并導致細胞增殖相關靶基因通過酪氨酸激酶受體(ERBB2)通路表達上調，抑制髓核細胞凋亡。Xie等[20]也在分析circRNAs芯片數據的基礎上發現，circERCC2在椎間盤退變過程中低表達，并通過體內和體外實驗證實circERCC2可通過與miR-182-5p結合而調控去乙酰化酶SIRT1(Sirtuin1)的表達，而SIRT1又可通過SIRT1/Parkin途徑調控細胞的自噬和凋亡[21-24]。Cui等[25]通過siRNA干擾髓核細胞中circ_001653的表達并進行流式細胞檢測發現，與對照組比較，干擾組中G1期細胞數量減少而S期細胞數量增多，說明circ_001653能夠抑制髓核細胞增殖。此外，circVMA21能通過影響X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的表達而調控髓核細胞凋亡，加快或延緩IDD進程[26]。

3.2 CircRNAs與ECM穩態 ECM是髓核細胞生存的微環境，主要由膠原蛋白、聚蛋白聚糖、非膠原蛋白、彈性纖維、糖蛋白及水組成，其中Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖是維持椎間盤正常結構和功能的最重要成分。在正常椎間盤中，ECM的分解和合成相對穩定，各種原因引起的ECM分解增加都會對椎間盤的正常結構和功能產生不良影響，如Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖過度分解會引起纖維環溶解，髓核脫水和纖維化，以及軟骨終板鈣化[27]，還會使ECM的吸水性減弱、含水量降低，導致椎間盤不能耐受壓力，髓核細胞也會因為缺乏營養物質和生長因子而凋亡，繼而加速IDD過程[28]。目前研究發現，circRNAs調控ECM主要通過影響ECM代謝和調控促炎因子的表達兩種方式。

3.2.1 CircRNAs與ECM代謝 基質金屬蛋白酶(M M Ps)及血小板反應蛋白去整合素金屬肽酶(ADAMTSs)是降解ECM中膠原蛋白和聚蛋白聚糖的主要酶。研究顯示，MMPs和ADAMTSs在IDD組織中表達升高，而抑制其表達可促進ECM修復并延緩IDD進程[29]。Guo等[30]通過RT-qPCR技術對比了正常和退變的髓核組織，發現circFAM169A在退變組織中表達增高，隨后通過細胞實驗證實circFAM169A能通過miR-583/BTRC途徑激活NF-κB通路，促進髓核細胞中MMP-13和ADAMTS-5的合成，進而降低ECM中Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖的含量，促進IDD的發生。Cui等[25]通過分析芯片數據發現，circ_001653在椎間盤退變組織中高表達，且circ_001653能下調miR-486-3p介導的細胞遷移，從而誘導透明質酸結合蛋白(CEMIP)的表達，促進MMP-3、MMP-13和ADAMTS-4、ADAMTS-5的合成，影響ECM中Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖的含量，加速IDD進程。除了能促進ECM分解外，部分circRNAs還可抑制MMPs和ADAMTSs的表達，從而抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的過度降解，延緩IDD進程。Chen等[31]應用免疫熒光和Western blotting檢測發現，circGLCE在退變組織中表達下降，而circGLCE能抑制MMP-13和ADAMTS-4的合成、增加ECM中Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖的含量，表明circGLCE在IDD過程中起保護作用。Song等[32]發現，circRNA_104670可以與miR-17-3p直接結合，而miR-17-3p的靶基因為MMP-2，所以circRNA_104670能間接調控MMP-2的表達，延緩ECM中Ⅱ型膠原蛋白的分解。此外，circRNAs還能通過影響炎性因子的表達、調節壓力負荷誘導的基質降解等方式，間接延緩IDD的進程，如circ_4099、circCIDN等[33-34]。

3.2.2 CircRNAs與促炎因子 研究表明，促炎因子增多也是IDD的主要特征之一，其能刺激神經內生長并引起神經性疼痛，是造成腰背痛的主要原因[35]。促炎因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)和干擾素(IFN)等，主要由髓核細胞分泌[36]，其中TNF-α和IL-1β的研究最為深入。IL-1β和TNF-α能誘導ECM降解相關酶基因的表達，如MMP-1、3、7、9、13和ADAMTS-1、4、5、9、15等，所以抑制促炎因子的表達能維持ECM穩態、緩解椎間盤退變[37]。目前研究發現，多種circRNAs可作為ceRNA與miRNAs結合，調控下游促炎因子的表達，影響IDD的病理進程。Guo等[30]研究發現，circFAM169A在退變的髓核組織中高表達，且能作為miR-583的ceRNA與其競爭性結合，影響miR-583對下游靶基因BTRC的調控，而BTRC能使NF-κB的結合物降解，激活NF-κB通路誘導的IL-1β和TNF-α的表達，上述促炎因子已被證實可以降解ECM、加重IDD[37]。Cui等[25]的研究發現，circ_001653能通過與miR-486-3p競爭性結合，間接調控其靶基因CEMIP介導的TNF-α和IL-1β表達，致使促炎因子介導的ECM降解作用增強。Wang等[38]通過研究IL-1β介導的IDD模型發現，過表達的circSEMA4B能競爭性結合miR-431，促進Wnt/β-catenin通路介導的ECM分解。此外，TNF-α還能通過NF-κB/MAPK通路誘導circ_4099的表達，而升高的circ_4099能通過miR-6161-5p/Sox9信號軸調節轉錄因子Sox9對Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖的表達，起到維持ECM穩態和保護椎間盤的作用[33]。

3.3 CircRNAs與壓力負荷 椎間盤作為一個吸收和緩沖機械應力的結構，在日常生活中會受到不同程度的壓力負荷。研究表明，過度的壓力負荷會增加普通人群患IDD的風險，而且機械應力也是導致椎間盤重塑的主要原因[39]。已有研究證實，過度的壓力負荷會誘導髓核細胞凋亡和ECM降解，加速IDD進程[40-41]。Xiang等[34]初次揭示了壓力損傷中circRNAs的作用，通過對比壓力損傷的髓核細胞和正常髓核細胞中circRNAs的表達變化發現，circCIDN在壓力損傷細胞中表達顯著降低。隨后，通過分析StarBase和TargetScan數據庫，預測circCIDN可能通過與miR-34a-5p結合，影響其靶基因SIRT1對髓核細胞自噬、凋亡以及衰老的調控功能，并通過細胞和動物實驗進行了驗證。此外，軟骨終板變性也是IDD的主要改變之一。Xiao等[42]研究發現，壓力負荷能夠誘導終板軟骨細胞表達circRNA_0058097，而后者可通過miR-365a-5p/HDAC4通路導致終板軟骨細胞退變。所以，壓力負荷導致的circRNAs改變也在IDD過程中起到重要作用。圖1簡要總結了上述與IDD相關的circRNAs的表達差異及作用機制，如circFAM169A在退變組織中表達升高，繼而競爭性結合miR-583，阻斷了miRNA對下游BTRC/NF-κB通路的抑制作用，該通路激活會誘導TNF-α和IL-1β的表達，促進ECM降解，加重IDD。

4 CircRNAs的臨床研究價值

4.1 作為疾病診斷的標志物 CircRNAs的特殊閉環結構能夠保護其不受核酸外切酶的影響，所以較線性RNA分子更加穩定。有研究顯示，circRNAs的半衰期是線性RNA的2.5倍[43]。CircRNAs具有穩定性好、表達豐度高的特點，且在不同疾病中存在明顯的表達差異，在疾病的臨床診斷中具有潛在的實用價值[44]。表1總結了部分可作為骨科疾病診斷標志物的circRNAs。隨著circRNAs研究的不斷深入，將來會有更多與疾病相關的circRNAs被發現并運用到各種疾病的診斷中。

圖1 CircRNAs在椎間盤退變組織中的表達差異及作用機制Fig.1 Expression differences and mechanisms of circRNAs in the degenerative tissue of intervertebral disc

表1 常見骨科疾病的診斷標志物circRNAsTab.1 The circRNAs as biomarkers in common orthopedic diseases

4.2 作為疾病的靶向治療藥物 隨著對外泌體研究的不斷深入，人們發現其包含的內容物非常廣泛，包括各種生長因子、蛋白質、脂質、核酸和circRNAs等[51]，而且外泌體中含有的circRNAs豐富且穩定，并可在外周循環和尿液中檢測到[52]。最近研究發現，包含circRNA_0000253的外泌體在退變組織中含量最高，且能通過miR-141-5p/SIRT1軸促進IDD，表明circRNAs可通過外泌體轉運的方式轉移至不同組織而發揮生物學功能，這為生物治療(包括基因靶向治療)提供了理論依據，使其有望成為一種新型的靶向治療藥物[53]。

綜上所述，近年來，IDD的發病率逐年增高且發病人群呈年輕化趨勢，目前最有效的治療措施仍是外科手術，雖然手術治療能緩解或消除患者的癥狀，但并不能逆轉IDD的進程，所以亟需新的有效的治療手段。隨著芯片測序和生物信息學的快速發展，越來越多的研究證實circRNAs在多種疾病的發生發展過程中發揮著重要調控作用。目前研究發現，circRNAs在IDD進程中主要充當ceRNA而發揮miRNA“海綿”的作用，通過結合miRNAs影響其對靶基因轉錄和翻譯的調控，而circRNAs在IDD中是否具有其他生物學功能仍需進一步研究。由于circRNAs具有穩定性、保守性及組織特異性等特點，并且能通過外泌體轉運至靶組織發揮生物學效應，其在疾病篩查、診斷和藥物靶向治療方面具有巨大潛能，因此未來需進一步研究circRNAs在IDD診斷和治療中的作用。