新型冠狀病毒ORF 1ab/S/M蛋白遺傳進化分析及mRNA疫苗 抗原表位序列篩選

常凱，劉晨霞，朱紫衣，許宏宣，王艷艷，熊杰，曲遠青，江忠勇*

1解放軍西部戰區總醫院檢驗科，成都 610083；2四川省簡陽市人民醫院檢驗科，四川簡陽 611730；3成都市實驗外國語學校生物教研組，成都 611130

冠狀病毒是屬于冠狀病毒科的一種有包膜的單股正鏈RNA病毒[1]，分為α、β、γ和δ屬。其中α、β冠狀病毒僅感染哺乳動物，目前已知的冠狀病毒堿基數約為30 kb[2]。當前有6種冠狀病毒可感染人類致病，主要引起呼吸道感染，其中兩種高致病性冠狀病毒為嚴重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征(MERS)冠狀病毒(MERS-CoV)，其他4種低致病性冠狀病毒(229E、HKU1、OC43、NL63)引起的輕度呼吸道疾病占呼吸道感染性疾病的10%～30%[3]。研究發現，引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)與MERS-CoV、SARS-CoV具有較高的同源性[4]，臨床癥狀以發熱、乏力、干咳為主，少數伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹痛等癥狀。治療多在對癥的基礎上防治并發癥等，暫無特異性藥物[5-6]。 盡管多國采取了嚴格的防控措施，但疫情仍然急速發展且造成了全球大流行[7]，針對這一公共衛生安全事件，各國對疫苗研發與診斷試劑的精度提出了更高的要求。SARS-CoV-2的基因組由6個主要的功能性開放閱讀框(ORF)組成，包括ORF 1ab、S、E、M、N和其他輔助基因，其中ORF 1ab、刺突蛋白(S蛋白)和膜蛋白(M蛋白)在病毒感染與致病中發揮著重要作用[8-10]。本研究基于SARS-CoV-2病毒遺傳特征與全球公共數據庫資源，應用生物信息學方法快速篩選有效抗原表位序列，以期為mRNA疫苗、血清學診斷性試劑的研發與優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據收集 檢索NCBI、EMBL、DDBJ數據庫收集全球SARS-CoV-2全基因組序列，應用Vector NTI及DNA star軟件分析全基因組ORF，基于已有的SARS-CoV功能研究，剪切提取SARS-CoV-2的ORF 1ab、S蛋白和M蛋白的ORF。將3種ORF分別翻譯為氨基酸序列并儲存于物理庫備用。

1.2 SARS-CoV-2 ORF 1ab/S/M蛋白遺傳分析 應用Clustal X軟件將ORF 1ab、S蛋白和M蛋白的核酸序列進行Clustal W對位分析，應用MEGA 7.0軟件基于鄰位相連法(Neighbor-Joining)構建進化樹[11]。 構建參數為發展史檢測(無)、分布方式(泊松分布)、Gap處理(完全刪除)。基于不同國家檢出的序列的遺傳距離繪制全球SARS-CoV-2遺傳變異分布圖。

1.3 SARS-CoV參考抗原及其與SARS-CoV-2的相似性分析 應用IEDB數據庫檢索SARS-CoV抗原及抗原決定簇，對比分析SARS-CoV-2與SARS-CoV的ORF 1ab、S、M序列的同源性和相似性，篩選共有的抗原決定簇。

1.4 SARS-CoV-2抗原表位預測分析 應用IEDB數據庫在線預測工具檢索SARS-CoV-2的B細胞抗原決定簇，檢索條件為抗原表位(線性表位)、免疫細胞(所有免疫細胞)、宿主(人)、疾病(病毒性感染性疾病)；檢索SARS-CoV-2的T細胞抗原決定簇，檢索條件為HLA等位基因、免疫細胞(所有免疫細胞)、宿主(人)、IC50＜500 nmol/L、匹配度等級＜0.1、抗原表位長度為默認值，結合SARS-CoV序列及全球SARS-CoV-2保守序列分析，篩選mRNA疫苗候選抗原表位。

2 結 果

2.1 ORF 1ab編碼蛋白遺傳分析 應用NCBI_PDB數據庫收集全球重點COVID-19暴發地區SARSCoV-2核酸序列610條，氨基酸序列74條。應用Vector NTI、Clustal X及MEGA 7.0對ORF 1ab蛋白的核酸與氨基酸序列構建進化樹，結果顯示，核酸序列相似性為100.0%，同源性為99.3%，其中巴基斯坦地區(MT262993.1)在5749-5769位存在缺失，美國威斯康星州(MT039887.1)在6532-6534位存在缺失；變異氨基酸主要集中在序列中末端。由于核酸變異多發生在密碼子的二、三位中，因而氨基酸水平的變異程度低于核酸水平。ORF 1ab蛋白遺傳變異全球分布顯示，美洲地區與亞歐地區存在明顯差異(圖1A)。

2.2 S蛋白遺傳分析 應用Vector NTI、Clustal X及MEGA 7.0軟件對S蛋白的核酸與氨基酸序列構建進化樹，結果顯示，核酸序列相似性為100.0%，同源性為97.5%，其中印度(MT012098.1)在459-461位存在堿基突變；SARS-CoV-2 S蛋白相對保守，哥倫比亞地區所在的美洲與歐亞地區遺傳差異明顯(圖1B)。

2.3 M蛋白遺傳分析 應用Vector NTI、Clustal X及MEGA 7.0對M蛋白的核酸與氨基酸序列構建進化樹，結果顯示，核酸序列相似性為100.0%，同源性為99.9%，其中僅美國伊利諾伊州(MN988713.1、MT044257.1)和加利福尼亞州(MT994467.1)在第207位存在堿基突變；SARS-CoV-2 M蛋白相對保守，可分為美國部分州與全球其他暴發地區兩大類 (圖1C)。

圖1 SARS-CoV-2 ORF 1ab/S/M蛋白進化樹分析Fig.1 The ORF 1ab/S/M protein neighbor-joining tree of SARS-CoV-2

2.4 SARS-CoV參考抗原及其與SARS-CoV-2的相似性分析 應用IEDB數據庫檢索到SARS-CoV抗原決定簇377個，抗原11個。其中S蛋白含抗原決定簇210個，M蛋白含21個，ORF 1ab蛋白含3個。本研究中用于與SARS-CoV-2進行比對的抗原均為有文獻表明可產生中和抗體的抗原，參與比對的抗原決定簇源于上述檢索的11個抗原。對SARS-CoV與SARS-CoV-2的ORF 1ab、S、M蛋白進行相似性與同源性分析，結果顯示，ORF 1ab蛋白氨基酸序列相似性96.7%，同源性94.5%；S蛋白氨基酸序列相似性84.1%，同源性75.6%；M蛋白氨基酸序列相似性100.0%，同源性100.0%(圖2)。

2.5 SARS-CoV-2 ORF 1ab/S/M蛋白序列線性表位預測分析 應用IEDB數據庫預測分析ORF 1ab蛋白氨基酸序列的B細胞響應表位顯示，共110條肽段存在B細胞響應區域。將長度＞10的肽段結合上述全球各地區ORF 1ab蛋白保守區域和SARS-CoV ORF 1ab蛋白保守區域進行分析發現，共15條滿足要求，其中11條對應的mRNA序列高度保守，可作為mRNA疫苗候選目標序列(表1)。預測分析ORF 1ab蛋白氨基酸序列的T細胞響應表位，按過濾條件檢索MHC Ⅰ和MHC Ⅱ數據庫中SARS-CoV-2含有的抗原表位發現，共15條滿足要求，其中13條對應的mRNA序列高度保守，可作為mRNA疫苗候選目標序列 (表2、圖3A)。

圖2 SARS病毒ORF 1ab/S/M蛋白序列參考抗原及相似性分析Fig.2 ORF 1ab/S/M protein sequence reference antigen of SARS-CoV and similarity analysis between SARS-CoV and SARSCoV-2

表1 SARS-CoV-2 ORF 1ab蛋白B細胞響應mRNA疫苗候選序列Tab.1 The mRNA vaccine candidate sequence in B cell of SARS-CoV-2 ORF 1ab protein

表2 SARS-CoV-2 ORF 1ab蛋白T細胞響應mRNA疫苗候選序列Tab.2 The mRNA vaccine candidate sequence in T cell of SARS-CoV-2 ORF 1ab protein

應用IEDB數據庫預測分析S蛋白氨基酸序列的B細胞響應表位顯示，共68條肽段存在B細胞響應區域。將長度＞10的肽段結合上述全球各地區S蛋白保守區域和SARS-CoV S蛋白保守區域進行分析發現，共15條滿足要求，其中6條對應的mRNA序列高度保守，可作為mRNA疫苗候選目標序列(表3)。預測分析S蛋白氨基酸序列的T細胞響應表位顯示，共15條滿足要求，其中4條對應的mRNA序列高度保守，可作為mRNA疫苗的候選目標序列(表4、 圖3B)。

應用IEDB數據庫預測分析M蛋白氨基酸序列的B細胞響應表位顯示，共6條肽段存在B細胞響應區域，將長度＞10的肽段結合上述全球各地區M蛋白保守區域和SARS-CoV病毒M蛋白保守區域進行分析發現，共3條對應的mRNA序列高度保守，可作為mRNA疫苗候選目標序列(表5)。預測分析M蛋白氨基酸序列的T細胞響應表位顯示，共8條滿足要求，其中7條對應的mRNA序列高度保守，可作為mRNA疫苗候選目標序列(表6、圖3C)。

3 討 論

近年來全球經歷了多次高致病性冠狀病毒大暴發：2002年的SARS-CoV、2012年的MERS-CoV和2019年的SARS-CoV-2[12]。當前臨床治療COVID-19的方法主要分為抗病毒、抗菌和針對危重患者的特殊治療，并無特異性藥物，其對全球公共衛生系統帶來了嚴峻的挑戰。采用疫苗防控SARS-CoV-2是最為可行的方法之一。現有的疫苗研發路徑包括滅活疫苗、核酸疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗等[13]。mRNA疫苗作為一種新型疫苗，具有安全性高、有效性高和生產便捷等優點[14]。本研究通過分析SARS-CoV-2具有免疫原性的ORF 1ab/S/M蛋白及mRNA序列特征，結合已有的SARS-CoV研究基礎，篩選可用于mRNA疫苗研發的抗原決定簇候選靶序列[15]。基于生物信息學分析結果的有效解讀和應用，可縮短探索制備有效mRNA疫苗的時間，提高篩選效率，為mRNA疫苗的穩定性修飾提供參考。

表3 SARS-CoV-2 S蛋白B細胞響應mRNA疫苗候選序列Tab.3 The mRNA vaccine candidate sequence in B cell of SARS-CoV-2 S protein

表4 SARS-CoV-2 S蛋白T細胞響應mRNA疫苗候選序列Tab.4 The mRNA vaccine candidate sequence in T cell of SARS-CoV-2 S protein

表5 SARS-CoV-2 M蛋白B細胞響應mRNA疫苗候選序列Tab.5 The mRNA vaccine candidate sequence in B cell of SARS-CoV-2 M protein

表6 SARS-CoV-2 M蛋白T細胞響應mRNA疫苗候選序列Tab.6 The mRNA vaccine candidate sequence in T cell of SARS-CoV-2 M protein

圖3 SARS-CoV-2 ORF 1ab/S/M蛋白序列線性表位預測分析Fig.3 Forecast analysis of linear epitopes from ORF 1ab/S/M protein sequence of SARS-CoV-2

隨著疫情的發展，針對SARS-CoV-2感染的多款檢測試劑盒相繼通過國家應急審批進入市場。RTPCR法可直接檢測病毒RNA，但檢測結果易受多種環境因素干擾，且存在檢測周期長等弊端[16]。抗體檢測(如膠體金法、化學發光法等)具有標本采集流程標準化、特異性高、檢測周期短、成本低、便攜等優點，有利于對SARS-CoV-2感染人群進行常規篩查[17]。本研究結果也為SARS-CoV-2血清學診斷試劑的研發及免疫機制研究提供了參考，有助于獲得更為優化與穩定的抗體。

SARS-CoV-2與SARS-CoV在臨床表現、傳播途徑等方面高度相似，全基因序列具有75%的相似性。而其ORF 1ab、S和M蛋白核酸序列相似性較高，使兩種病毒的傳播效力及致病力高度相似，但兩者仍存在差異。結合ORF 1ab、S和M三種蛋白序列的位點突變及遺傳進化分析發現，美洲地區與亞歐大陸的SARS-CoV-2病毒具有明顯差異。

通過結合已有的SARS-CoV研究基礎和全球熱點區域全基因組比對分析，預測ORF 1ab、S和M蛋白的B細胞線性抗原表位mRNA序列分別為11條、6條和3條，T細胞線性抗原表位mRNA序列分別為13條、4條和7條。B細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞，漿細胞可合成和分泌抗體，主要執行機體的體液免疫功能。而T細胞在抗體傳遞，產生、儲存記憶細胞和殺傷細胞等方面起著重要作用，主要執行機體的細胞免疫功能。因此篩選SARS-CoV-2中能夠激活免疫細胞的抗原決定簇對抗病毒免疫機制研究具有重要意義，可為人工構建mRNA疫苗(串聯抗原表位)和制備診斷抗體提供參考。