GSDMD基因敲除對內毒素所致小鼠急性肺損傷的保護作用

帥維正，李軍，李大偉，鄒劍峰，胡子龍，李琦，李哲，趙哲，張志成*

1解放軍總醫院第六醫學中心重癥醫學科，北京 100048；2解放軍總醫院第六醫學中心衛勤部，北京 100048；3新華通訊社門診部，北京 100803

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種常見的呼吸危重癥[1-2]，其特點為發病急驟、來勢兇猛，主要表現為進行性加重的呼吸衰竭，且傳統的常規治療手段難以糾正。目前認為，炎癥反應失控是ALI發生和進展的內在原因，其特征性的病理改變是由肺微血管通透性增加而導致的肺水腫、透明膜形成以及肺纖維化[3]；而這一改變的本質是肺內炎癥反應顯著且不斷級聯擴大，進而導致肺血管內皮屏障及肺泡上皮屏障受損。焦亡是新發現的炎癥性的程序性細胞死亡方式，具有獨特的作用機制和生理效應[4]，其發生過程由炎癥性半胱氨酸蛋白酶(caspases)所調控，發生時效應分子導致靶細胞的細胞膜上出現特異性小孔，進而導致細胞膜兩側離子濃度差消失，細胞發生腫脹和崩解[5-7]。 焦亡不但可導致效應細胞死亡，通常還伴隨炎性因子的分泌、釋放和機體炎癥反應的上調[8]。目前發現，gasdermin D(GSDMD)蛋白是細胞焦亡經典途徑和非經典途徑的共同效應分子[9]。GSDMD蛋白除了導致細胞焦亡，還可調控炎性因子的釋放。有研究發現，GSDMD的上游調控蛋白參與了脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致ALI的發病過程，但目前尚無研究關注GSDMD蛋白是否參與并調控了ALI的發生和發展。為此，本研究比較了野生型與GSDMD基因敲除小鼠在LPS導致ALI后肺部炎癥水平和組織損傷的差異，以揭示和評價GSDMD蛋白對LPS所致ALI的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 戊巴比妥鈉、LPS、多聚甲醛(美國Sigma公司)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)(上海博谷生物科技有限公司)；無水乙醇(上海珊億化工科技有限公司)；GSDMD蛋白一抗、caspase-1蛋白一抗、caspase-11蛋白一抗(美國Abcam公司)；引物(北京諾賽基因組研究中心有限公司)；小鼠IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為

世紀生物科技有限公司)。Model 680酶標儀(美國Bio-Rad公司)；ECLIPSE Ti-S熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；ImageQuantTMLAS4000數字成像系統(美國GE公司)。

1.2 實驗動物及分組 C57BL/6小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心，GSDMD基因敲除小鼠由廈門大學韓家淮院士惠贈。入組小鼠8～10周齡，體重25～30 g，SPF環境下分籠飼養，食物及水按時攝入，晝夜節律規律。于造模前12 h禁食、4 h禁水。隨機分為野生型對照組(WT-sham組)、野生型ALI組(WT-ALI組)、基因敲除型對照組(KO-sham組)、基因敲除型ALI組(KO-ALI組)，每組10只。ALI組使用LPS氣管內滴入制作小鼠ALI模型，對照組予以相同體積的PBS溶液。本研究體內實驗流程經過解放軍總醫院第六醫學中心動物倫理委員會審批，所有研究操作均遵循國家實驗動物飼養健康指南規范。

1.3 小鼠ALI模型制備 根據文獻方法制作內毒素所致肺內源性ALI小鼠模型[10-12]。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉小鼠，然后將小鼠四肢及上顎固定于傾斜臺面上，頭高尾低。使用冷光源緊貼照射小鼠頸部氣管位置，使用鑷子將舌體牽拉固定，可以看到小鼠呼吸聲門開閉時的光點出現。對準光點置入由20G套管針改造的氣管插管，插管成功后滴入LPS溶液(1 mg/kg)，推注后短暫封閉氣管插管5～10 s，使LPS溶液在全肺中均勻分布。對照組小鼠氣管滴入等體積的PBS溶液。

1.4 標本采集 每只小鼠留取左肺肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，右上肺行病理活檢，右下肺用于測量肺濕/干重比(W/D)。

1.4.1 肺組織病理學觀察及肺損傷嚴重程度評價 將小鼠右上肺沖洗干凈后使用4%多聚甲醛固定，過夜。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟3次，包埋、切片、脫水、透明、封片。光鏡下觀察肺組織病理學變化，并進行肺損傷半定量評分。采用2011年美國胸科醫師協會發布的實驗動物急性肺損傷病理評分系統[10]，根據肺泡腔內中性粒細胞、肺間質內中性粒細胞、透明膜、肺泡腔中填充蛋白質碎片的數量以及肺泡間隔增厚的程度進行評分，最后根據各項結果進行加權計算后得出肺損傷半定量評分。每個標本隨機選取10個高倍鏡視野進行觀察，由病理學專家進行獨立評價。

1.4.2 收集BALF 給藥6 h后，放血處死小鼠，胸壁正中切口剪開胸腔。結扎右肺，用預冷的PBS灌洗左肺，收集BALF，每次推注1 ml PBS，輕度反復灌洗3次，停留2 min后抽出，BALF回收率＞80%為有效。將BALF于4 ℃下500×g離心5 min，取上清， -80 ℃保存。檢測炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平和總蛋白含量。

1.4.2.1 ELISA法測定BALF中TNF-α、IL-6及IL-1β水平 按照小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測試劑盒說明書操作，設置3個復孔，檢測炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。

1.4.2.2 BCA法測定BALF中總蛋白含量 取100 μl牛血清蛋白(BSA)標準品溶液，濃度為2000 pg/μl，作為標準曲線的最高濃度，依次倍比稀釋5次。采用酶標儀測定590 nm波長處的吸光度(OD)值，制作標準曲線。

將稀釋好的BSA標準品和BALF樣品加入96孔酶標板中，每孔25 μl，設置3個復孔。每孔加入200 μl BCA工作液，混勻并覆蓋后，37 ℃靜置30 min，完成后在5 min內采用酶標儀測定590 nm處的OD值，計算總蛋白含量。

1.4.3 測量肺組織W/D 取右下肺組織，準確稱重并記錄，置于80 ℃烘烤24 h后再次稱重，計算前后兩者的比值，即為肺組織W/D。

1.5 Western blotting檢測焦亡相關蛋白表達 用PBS清洗剩余肺組織，在200目篩網上研磨。取組織懸液，裂解紅細胞，離心。漂洗后，加入RIPA裂解液，振蕩混勻，冰上放置30 min。4 ℃下12 000×g離心10 min，棄沉淀取上清，測定總蛋白含量。

制膠后加樣10 μl。電泳80 V，20 min，然后調至120 V，50 min。轉膜后，將PVDF膜加入現配的5% TBST牛奶封閉液中，封閉2 h。封閉完成后洗膜3次。按試劑說明書孵育一抗和二抗(北京華興博創基因技術有限公司，1:10 000)，目的蛋白一抗分別為抗caspase-11抗體 (ab128850，1:1000)、抗caspase-1抗體 (ab138483，1:1000)、抗GSDMD 抗體 (ab209845，1:1000)。完成后發光顯影，測定焦亡相關蛋白caspase-1、caspase-11、GSDMD和GSDMD-NT的表達水平，使用ImageQuantTMLAS4000數字成像系統進行發光及圖像分析。

1.6 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，EXCEL軟件進行數據記錄和作圖分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠肺組織病理學檢測及肺損傷半定量評分結果比較 HE染色結果顯示，WT-sham組和KOsham組小鼠肺泡間隔無水腫，肺泡腔無滲出，無明顯炎性細胞聚集。LPS氣管滴注后，WT-ALI組小鼠出現典型的肺損傷病理改變：肺泡結構破壞，中性粒細胞進入肺泡腔和肺間質，肺泡透明膜形成和肺泡間隔增厚。而KO-ALI組小鼠的肺組織病變程度較WT-ALI組明顯減輕，肺泡腔內壞死組織填充較少，炎性細胞浸潤程度較輕，肺泡間隔增厚不明顯。如圖1所示。肺損傷半定量評分結果顯示，WT-ALI組和KO-ALI組肺損傷半定量評分均明顯高于WT-sham組和KO-sham組(P＜0.01)，KO-ALI組肺損傷半定量評分明顯低于WT-ALI組(P＜0.01，圖2)。

2.2 各組小鼠肺組織W/D比較 WT-ALI組小鼠肺組織W/D明顯高于其他各組(P＜0.01)，KO-ALI組與KO-sham組、WT-sham組相比均未見明顯差異(P＞0.05，表1)。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化(HE ×200)Fig.1 Histopathological changes of lung tissue in each group of mice (HE ×200)

圖2 各組小鼠肺損傷半定量評分比較(n=10)Fig.2 Comparison of semi-quantitative score of lung injury in each group of mice (n=10)

2.3 各組小鼠BALF中總蛋白含量比較 BCA法檢測結果顯示，WT-ALI組小鼠BALF中總蛋白含量明顯高于其他各組(P＜0.01)，KO-ALI組小鼠BALF中總蛋白含量與KO-sham組和WT-sham組相比均未見明顯差異(P＞0.05，表1)。

2.4 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平比較 ELISA法檢測結果顯示，LPS處理后，WTALI組小鼠BALF中TNF-α水平明顯高于其他各組(P＜0.05)，而KO-ALI組小鼠BALF中TNF-α水平明顯高于KO-sham組和WT-sham組小鼠(P＜0.05)。W T-ALI組小鼠BALF中IL-1β和IL-6的水平最高(P＜0.01)，KO-ALI組則低于WT-ALI組，高于KOsham組和WT-sham組小鼠(P＜0.01，表1)。

2.5 各組小鼠BALF及肺組織中焦亡相關蛋白的表達 Western blotting檢測結果顯示，LPS處理后，野生型小鼠BALF及肺組織中均有GSDMD蛋白表達，且可觀察到活化的氮端殘基(NT)。基因敲除小鼠則既無GSDMD蛋白表達，也無活化的GSDMD-NT表達。LPS處理后，野生型小鼠和基因敲除小鼠BALF及肺組織中caspase-1和caspase-11的表達均明顯增加(P＜0.01，圖3)。

表1 各組小鼠肺的炎性指標檢測結果(±s，n=10)Tab.1 Detection of inflammatory indicators of the lungs in each group of mice (±s, n=10)

表1 各組小鼠肺的炎性指標檢測結果(±s，n=10)Tab.1 Detection of inflammatory indicators of the lungs in each group of mice (±s, n=10)

與WT-sham組比較，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01；與WT-ALI組比較，(3)P＜0.05，(4)P＜0.01；與KO-sham組比較，(5)P＜0.05，(6)P＜0.01。

組別TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)總蛋白含量(μg/ml)肺組織W/D WT-sham組15.97±3.2718.44±2.1128.37±8.56198.95±20.483.89±0.26 WT-ALI組523.15±79.79(1)40.31±6.25(2)456.2±64.21(2)305.61±31.70(2)4.45±0.21(2)KO-sham組15.97±4.00(3)19.87±1.92(4)26.37±4.07(4)199.01±20.51(4)3.91±0.36(4)KO-ALI組421.74±39.93(1)(4)(5)29.02±6.10(2)(4)(6)258.36±21.91(2)(4)(6)227.61±38.35(4)3.99±0.12(4)

圖3 各組小鼠BALF及肺組織中焦亡相關蛋白的表達(Western blotting)Fig.3 Expression of pyroptosis-related proteins in BALF and lung tissues in each group of mice (Western blotting)

3 討 論

本研究構建了GSDMD基因敲除小鼠經氣管滴注LPS的ALI模型，并將其與野生型小鼠進行比較，結果顯示，與野生型小鼠相比，基因敲除小鼠在LPS致傷后肺損傷以及肺泡毛細血管屏障功能損害較輕，肺內炎癥水平較低。ALI的本質是感染或非感染因素導致的炎癥反應級聯放大后的失控與失衡[13]。 近年來研究發現，焦亡參與了抵御病原體侵襲的過程。研究LPS誘導的內毒素休克小鼠模型發現，小鼠炎癥反應劇烈，進而出現多臟器功能損害和死亡，而使用焦亡抑制劑可明顯降低炎癥水平和模型動物的死亡率[14-16]。Caspase-1、caspase-11是小鼠細胞焦亡的上游調控蛋白。有學者在LPS所致ALI小鼠模型肺內發現了炎性小體、caspase-1的剪接活化和肺泡巨噬細胞死亡，從而提出肺泡巨噬細胞焦亡參與了LPS所致ALI的發生和發展，但是未能闡明caspase-1導致細胞焦亡的具體機制[17]。

最近發現，GSDMD蛋白是細胞焦亡的最終效應分子[18]。在細胞焦亡的發生過程中，被激活的caspase-1和caspase-11可以對GSDMD蛋白276位點的天冬氨酸進行剪切，所得到的GSDMD-NT是導致細胞焦亡的功能區域[19-21]。GSDMD蛋白N端殘基具有親脂性，可與細胞膜內側的膜脂和磷酸肌醇等特異性結合，發生低聚化并形成小孔，而這些小孔可導致細胞內外滲透壓差消失、細胞腫脹并最終溶解[9]。焦亡導致細胞死亡后，胞內內容物暴露于胞外，可進一步促進炎癥應激水平的上調而導致失控。Kayagaki等[22]發現，在LPS誘導的內毒素休克動物模型中，相較于野生型小鼠，GSDMD敲除小鼠死亡率明顯降低。目前已有研究提示焦亡上游調控蛋白參與了LPS所致的ALI的病理過程，但GSDMD蛋白作為焦亡的具體執行蛋白，是否在其中起到促進作用尚未見報道。為此，本研究比較了GSDMD基因敲除小鼠與野生型小鼠在LPS致傷后肺部損傷的差異，進而探索GSDMD蛋白在內毒素所致肺損傷中的作用。結果顯示，在LPS所致ALI的病理過程中，存在著GSDMD蛋白的表達和活化。既往未見肺組織中GSDMD蛋白表達的相關報道，而本研究對肺組織和BALF進行了GSDMD蛋白及其活性產物的Western blotting檢測，發現在使用LPS進行氣管滴注后，小鼠肺組織和BALF中均有GSDMD蛋白及其活性產物出現，首次在內毒素所致ALI小鼠模型中發現GSDMD蛋白活性形式的表達。這一結果與本課題組前期體外細胞實驗[23]所得到的證據相互印證，提示LPS對肺部直接刺激可能誘導肺組織細胞發生焦亡。此外，野生型小鼠和基因敲除小鼠BALF和肺組織中caspase-1和caspase-11的表達均上調，提示敲除GSDMD并未影響焦亡上游的經典和非經典調控途徑的激活。

為了進一步了解GSDMD蛋白活化在LPS所致ALI中的作用，本研究比較了GSDMD基因敲除小鼠與野生型小鼠的肺損傷程度和肺部炎癥水平。結果顯示，LPS致傷造模后，GSDMD基因敲除小鼠的肺損傷半定量評分、肺組織W/D、相關炎性因子水平均低于野生型小鼠。肺泡毛細血管屏障功能破壞是ALI的重要特征性表現[24]。本研究采用肺組織W/D 和BALF中總蛋白含量兩個指標來評估實驗動物肺泡毛細血管屏障功能，結果顯示，LPS處理后，GSDMD敲除小鼠肺組織W/D和BALF中總蛋白含量均明顯低于野生型小鼠，提示敲除GSDMD可以減弱LPS對肺泡毛細血管屏障的致傷效應。

ALI發病過程中，細胞網絡與細胞因子網絡的激活是炎癥反應級聯放大的重要因素，其中TNF-α和IL-1β是重要的前炎性因子[25]。IL-6在肺損傷病程中通過ERK途徑被上調表達，進而通過JAK/STAT、Ras/ERK和PI3-K/Akt途徑發揮促進B細胞分化和成熟、調節免疫球蛋白分泌，以及合成急性相蛋白等作用[26-27]。TNF-α、IL-1β及IL-6在ALI發病過程中均起促炎作用，其水平可提示肺損傷的嚴重程度。本研究中，LPS致傷后小鼠BALF中3種細胞因子水平均明顯升高，而GSDMD敲除小鼠低于野生型小鼠，提示敲除GSDMD可降低LPS所致的小鼠肺部炎癥水平，減輕肺部損害。

本研究存在一定的局限性：首先，雖發現了焦亡相關蛋白的表達，但未能在組織和細胞層面提供更進一步的證據；其次，雖對GSDMD蛋白在LPS所致ALI中的作用進行了觀察，但其具體作用和調控機制仍需深入研究。總之，經氣管滴注LPS可以誘導小鼠肺內出現GSDMD蛋白的表達和活化，而GSDMD基因敲除有助于降低肺組織中的炎癥水平并減輕肺組織損傷程度。

致謝：特此感謝廈門大學韓家淮院士、吳劍鋒教授惠贈GSDMD基因敲除小鼠并對本研究提供幫助。