膽道發育不良患兒的臨床病理特點及其預后影響因素分析

吳宙光，王斌，程珍，張文杰，葉泳欽，鄭佳辰

深圳市兒童醫院普外科，廣東深圳 518026

膽道發育不良(biliary dysplasia，BD)是一種由肝內外膽管發育異常引起的膽汁淤積性疾病，常伴隨進行性肝內小膽管損壞，從而導致膽汁入十二指腸減少和肝內膽汁淤積，病理學表現為肝內膽管數與匯管區膽管數比例明顯下降[1-2]。膽汁淤積性疾病的發生主要與代謝性疾病、病毒感染、中毒、膽管發育異常、膽汁分泌功能下降、基因異常等有關[1,3-4]。 嬰幼兒膽道發育不良若不能得到有效治療，常會導致膽汁淤積和膽道閉塞，發生肝纖維化和肝硬化，甚至肝衰竭[1,3,5]。在藥物治療的基礎上，常需行膽囊造瘺及膽道沖洗引流等外科手術治療，發生肝衰竭時甚至需行肝移植治療[1,3,5-6]。目前關于BD患兒臨床病理特點及其預后影響因素的研究較少。本研究旨在探討BD患兒的臨床病理特點及其預后不良的影響因素，以期為指導BD的精準個性化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月－2019年1月深圳市兒童醫院普外科收治的BD患兒32例，收集患兒的一般資料(包括年齡、性別、出生體重、母親生產方式、出現黃疸時間、尿液顏色、大便顏色、肝脾大情況、腹水情況、伴隨疾病情況、肝腎功能、手術日齡、膽道造影情況、用藥情況)，以及術中膽道造影和術后肝組織病理學資料。納入標準：符合BD診斷標準[肝活檢示肝小葉間膽管缺乏，即膽管數與匯管區比例＜0.5，膽管造影示肝外膽管顯影纖細(≤2 mm)，肝內膽管顯影細微且不清晰，腸道有造影劑滲入，臨床表現為進行性加重的梗阻性黃疸]。排除標準：膽道造影顯示為其他原因引起的膽汁淤積性肝病、膽道閉鎖或診斷不明。本研究通過深圳市兒童醫院倫理委員會批準。

1.2 治療方法 所有患兒均進行藥物(保肝藥、肝酶誘導劑、利膽藥)治療及藍光照射治療，藥物治療無明顯好轉且大便顏色淺、肝功能持續性損害的患兒進行外科手術治療(膽囊造瘺、膽道沖洗)，術后予以抗生素、保肝藥、利膽藥、激素、丙種球蛋白等治療，所有患兒手術順利，無明顯并發癥發生。

1.3 肝組織病理學觀察 術后采用肝穿刺針取少量肝右葉前緣組織，用10%多聚甲醛固定后于4 ℃冰箱保存。所有患兒肝穿刺術后無明顯出血情況。

1.3.1 HE染色 肝組織切片后行HE染色，倒置顯微鏡下觀察膽汁淤積、膽栓形成、炎性細胞浸潤、肝纖維化、肝細胞變性等情況。

1.3.2 免疫組化染色 肝組織切片后行免疫組化染色，先在枸櫞酸鹽緩沖液中修復抗原10～15 min，P B S 洗滌后，在1 0%山羊血清中封閉，加入一抗[EMA(ab70475，英國Abcam公司，稀釋倍數1:1000)、CK19(ab7754，英國Abcam公司，稀釋倍數1:1000)]4 ℃孵育過夜，孵育二抗(HRP標記山羊抗小鼠二抗ZB-2305，北京中杉金橋生物技術有限公司，稀釋倍數1:5000)，DAB顯影10 min，蘇木素/ 伊紅(HE)復染，漂洗、封片，顯微鏡下觀察。高倍鏡下采用病理圖像分析系統對組織病理結果進行判定，組織中出現棕黃色或棕褐色為相應的上皮膜抗原(EMA)、細胞角蛋白19(CK19)表達陽性。在表達陽性的部位各取5～10個不同視野，采用IPP圖像分析系統測定EMA和CK19蛋白的平均光密度值(AOD)。AOD為陽性細胞的光密度值與陽性細胞總面積的比值。

1.4 觀察指標 術后隨訪至2020年4月，觀察患兒肝功能[主要包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)等指標]、黃染情況、營養狀況、身高、體重、肝纖維化程度等預后情況。根據預后情況分為預后良好組與預后不良組，其中預后良好指術后6個月內迅速退黃(TBIL≤20 μmol/L)，患兒營養狀況、生長發育良好；預后不良指術后6個月內未退黃(TBIL＞20 μmol/L)，患兒營養狀況、生長發育不良，伴有并發癥甚至死亡。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計數資料以頻數(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；正態分布的計量資料以±s表示，非正態分布的計量資料以中位數表示，組間比較采用t檢驗或秩和檢驗。采用logistic回歸分析BD患兒預后不良的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BD患兒臨床病理特點分析 32例BD患兒中男19例，女13例，多為剖宮產足月兒(68.8%，22/32)；出生體重0.85～6.20(2.68±1.06) kg，處于正常范圍；出現黃疸時間(31.5±7.2) d；主要伴有尿色深(62.5%，20/32)、大便顏色淺黃(90.6%，29/32)、肝脾大(59.4%，19/32)及輕度腹水(40.6%，13/32)等癥狀；常伴有先天性心臟病(25.0%，8/32)等疾??；病毒感染以巨細胞病毒(56.3%，18/32)為主(表1)。

表1 BD患兒臨床病理特點(n=32)Tab.1 Clinicopathological features of children with BD (n=32)

2.2 BD患兒膽道造影及肝組織病理學特點分析 膽道造影結果顯示，所有BD患兒膽囊及膽管顯影，肝內膽管纖細，其中11例為肝外膽管纖細，6例為膽囊發育不良。BD患兒手術日齡為30～125(82.5±36.2) d，肝組織病理學表現為膽汁淤積、膽栓形成、肝小葉間膽管及匯管區膽管減少或消失、炎性細胞浸潤、肝細胞變性、點狀壞死、不同程度肝纖維化、肝內膽管增生，并伴有EMA、CK19陽性表達(圖1)。其中炎性細胞浸潤25例，肝細胞變性16例(水樣變性9例，空泡樣改變6例，纖維樣變1例)，點狀壞死11例，肝纖維化10例(Ⅰ級7例，Ⅱ級3例)。有5例患兒進行了基因檢測，其中2例為JAG1基因突變的Alagille綜合征患兒，余3例基因檢測陰性。

2.3 BD患兒隨訪情況及預后不良影響因素分析 術后隨訪14～74個月，中位隨訪時間50個月，其中20例預后良好(6個月內退黃，無明顯并發癥發生)，12例預后不良(10例6個月未退黃，5例出現術后肝功能損害等并發癥，3例術后皮膚瘙癢伴發育遲緩，2例貧血，2例死亡)，所有患兒均未進行肝移植治療。以手術日齡、性別、出生體重、母親生產方式、出現黃疸時間、尿液顏色、大便顏色、肝脾大、腹水情況、伴隨疾病情況、肝腎功能指標、病理學檢測結果為自變量，是否發生預后不良為因變量進行單因素logistic分析顯示，與預后良好組比較，預后不良組手術日齡，肝脾大、腹水、肝細胞變性、肝纖維化比例，TBIL水平以及EMA、CK19的表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05，表2)；將P＜0.1的因素納入多因素logistic回歸分析，結果顯示，手術日齡、肝纖維化、TBIL及EMA、CK19的表達為BD患兒預后不良的影響因素(P＜0.05，表3)。

3 討 論

BD是肝內或肝外膽道發育不良引起的進行性膽汁淤積性疾病，常被誤診為膽道閉塞。研究發現，BD是形成膽道閉鎖的一個中間階段，而膽管纖細可能會造成肝臟膽汁淤積，引起肝纖維化和肝硬化，甚至肝衰竭[1,3,7]。BD可分為綜合型和非綜合型兩類，其中綜合型小葉間膽管缺乏又名Alagille綜合征，臨床表現為心臟雜音、特殊面容、慢性膽汁淤積、角膜后胚胎環及蝴蝶椎骨等[1,8]；非綜合型小葉間膽管缺乏主要表現為無膽汁性糞便、黃疸，部分患兒可伴有先天性發育畸形，其發生主要與先天發育不良、膽道損傷后造成的膽道萎縮有關，病因多與染色體異常、代謝遺傳相關[1,5]。

圖1 BD患兒肝組織病理學特點Fig.1 Histopathological features of liver biopsy in children with BD

表2 BD患兒預后不良影響因素的單因素logistic回歸分析Tab.2 Univariate logistic regression analysis of the adverse factors affecting prognosis in children with BD

表3 BD患兒預后不良影響因素的多因素logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of the adverse factors affecting prognosis in children with BD

本研究分析32例BD患兒的臨床病理特點發現，男性患兒多于女性，多為剖宮產足月兒，出生體重正常，出現黃疸時間(31.5±7.2) d，伴有尿色深、大便顏色淺、肝脾大及輕度腹水等癥狀，常伴有先天性心臟病等疾病，且巨細胞病毒感染多見，這與既往研究結果較為一致[1,3,6-7]，表明BD是一種進行性膽汁淤積性疾病，可出現梗阻性膽汁淤積，同時伴隨多系統的損害，與病毒感染或免疫介導的損傷以及疾病的發生發展有關[3]。

BD患兒膽道造影可見肝內及肝外膽管纖細，膽囊發育不良，符合膽道系統的解剖學和病變特點。膽道纖細和膽囊發育不良易引起膽汁淤積。對于BD患兒常規行Kasai手術的效果并不顯著，術后可能出現感染、吻合口漏等風險，而采用膽道造瘺和引流手術配合利膽等藥物治療，可明顯減輕膽汁淤積性肝損害，盡可能減輕肝纖維化的程度以預防肝硬化的發生[1,9-10]。本研究中BD患兒手術月齡主要為2～4個月，表明早期手術治療能有效減輕肝臟進行性損害的程度。本研究肝活檢病理學觀察發現，BD患兒肝小葉間膽管及匯管區膽管減少或消失、膽汁淤積、膽栓形成、炎性細胞浸潤、肝細胞變性、點狀壞死、不同程度肝纖維化、肝內膽管增生，表明膽管缺乏會造成膽管系統處于高濃度膽汁酸中，反應性地造成膽管細胞和肝細胞變性損傷，觸發炎性細胞浸潤，導致肝纖維化的發生[5]。既往研究發現，大齡BD患兒(≥180 d)可出現進行性小葉間膽管數量減少或消失，肝內膽管增生和不同程度的膽汁淤積，且大齡組患兒較小齡組患兒肝纖維程度加重，表明小葉間膽管數量進行性減少可刺激肝內膽管增生等損傷修復反應[5]。本研究尚未對肝內膽管增生程度進行分析比較，今后需擴大樣本進一步探討。肝組織EMA、CK19免疫組化染色可提示肝內膽管減少或缺如的程度，與肝臟損傷程度相關[5,11]。此外，BD發病可能與基因變異相關，本研究通過基因檢測發現2例與JAG1基因突變相關的Alagille綜合征患兒，是綜合型膽道發育不良的基因診斷，此類患兒的病變多累及肝內外膽管，漸進性出現膽道閉鎖，最終發展為肝纖維化[12-13]。此外，有研究發現，部分BD患兒與NOTCH2基因突變有關[14-15]，但本研究并未檢測到，今后需擴大樣本量進一步研究。

本研究在預后分析中發現，手術日齡、肝纖維化、TBIL及EMA、CK19表達是BD患兒預后不良的影響因素。分析其原因如下：BD是一種進展性肝臟損害性疾病，手術日齡增加、膽汁淤積程度加重、TBIL表達量增加均會持續加重肝纖維化程度甚至引起肝硬化，與預后不良相關；而預后不良患兒常常出現膽汁淤積、皮膚瘙癢、營養狀況缺乏和生長發育受限等，這可能主要與肝臟損害引起肝酶、維生素等合成及分泌障礙有關[16]，而肝組織中EMA、CK19的表達量可反映肝損傷程度，其表達量增加多提示預后不良[5,11]。

綜上所述，BD患兒存在典型的臨床病理特點和膽道影像學特征，而手術日齡、肝纖維化、TBIL及EMA、CK19的表達是其預后不良的影響因素。今后仍需擴大樣本進一步研究證實，以期為BD的診斷和治療提供依據。