Wnt信號介導的肝巨噬細胞與肝祖細胞相互作用在肝纖維化發生與修復中的意義

簡 迅， 徐 瑩， 劉 平， 慕永平

上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海中醫藥大學肝病研究所， 上海 201203

肝纖維化是各種慢性肝病發展為肝硬化的必經之路，其病理特征為肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結節的形成。無論任何病因，慢性肝病進展到肝纖維化，均涉及肝實質的慢性損傷、持續的炎癥反應、纖維化的持續進展和創傷愈合反應[1]。因此，如何改善肝臟病理微環境，即抑制肝臟炎癥反應，促進肝祖細胞向有利于肝功能修復的肝實質細胞分化，成為肝纖維化治療研究的熱點。本文重點就巨噬細胞和內源性肝祖細胞在肝纖維化發生和修復過程中的作用，以及兩者之間的“對話”機制進行概述。

1 肝臟巨噬細胞的起源及其在肝纖維化發生與修復中的作用

巨噬細胞起源于單核細胞前體，是廣泛分布的吞噬性天然免疫細胞，具有吞噬、抗原提呈和活性分泌等多種功能，在組織內穩態和宿主防御中發揮重要作用[2]。巨噬細胞一旦定位于肝臟，即表現出較高的吞噬活性，以清除門靜脈來源的內毒素和有害物質[3]。肝臟巨噬細胞根據其來源可分為肝臟固有的巨噬細胞(Kupffer cell，KC)和循環中的單核巨噬細胞[4-5]。KC來源于卵黃囊和胎肝單核細胞，其表型特征為：F4/80hi、CD11blo、CD169+、CD68+、Mac-2+和CD80lo/-[6-8]。 其主要功能是清除血液中的微生物和細胞碎片，清除老化的紅細胞，確保肝臟內環境穩定[9-10]。 循環中單核細胞的表型特征為：F4/80int、CD11bhi和CD80hi，其主要功能是免疫監測[8]。當肝損傷時，KC可最早發現損傷并啟動炎癥級聯反應，通過分泌趨化因子CC基序配體(CC-motif ligand 2, CCL2)，募集外周淋巴細胞抗原6復合物，位點C(lymphocyte antigen 6 complex, locus C, Ly6C)+單核細胞大量浸潤[11]，Ly6C+單核細胞可分泌多種炎性細胞因子如TNF α、IL-1β、IL- 6、IL-12/23(P40)等，促進炎癥反應[12]。此外，Ly6Chi單核巨噬細胞還可分泌TGFβ1和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)-BB，介導肝星狀細胞(HSC)轉化為肌成纖維細胞[13]，分泌大量細胞外基質(ECM)，促進肝纖維化的進展[14]。同時，脾臟內的Ly6Clow單核細胞被募集進入肝臟后，可促進肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)-2/-9/-12/-13等的表達，進而促進損傷肝組織的修復[15]。因此，肝臟巨噬細胞在肝損傷的不同階段或修復反應中被激活，發揮促炎、促纖維化或促進創傷愈合/修復等作用[16]，提示調節巨噬細胞的活化狀態對肝纖維化的修復具有重要的臨床意義。

2 巨噬細胞極化狀態決定肝纖維化進展或修復

巨噬細胞是組織內穩態的精密傳感器，具有高度的可塑性，可根據環境信號快速地在促炎(M1巨噬細胞)和抗炎(M2巨噬細胞)之間進行表型轉換，稱之為巨噬細胞極化，M1和M2巨噬細胞在轉錄表達譜、細胞表面標志、細胞因子等方面均具有高度異質性，對纖維化肝臟中的ECM的沉積和組織重建發揮著雙重調節作用[17-18]。

巨噬細胞極化過程由復雜的分子機制調控，目前認為干擾素調節因子/信號轉導和轉錄激活因子/細胞因子信號抑制劑家族(interferon regulatory factor/signal transducer and activator of transcription/suppressor of cytokine signaling, IRF-STAT-SOCS)是其關鍵調節者。簡而言之，INFγ和Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)激活STAT1，促進M1極化，同時上調SOCS3，抑制M2極化；IRF5和IRF8通過Notch信號通路促進M1極化。IL-4和IL-13激活STAT6，促進M2極化，同時上調SOCS1，抑制M1極化；IL-10和IL-3分別激活STAT3和STAT5，促進M2極化[19]。在來自細菌的脂多糖(LPS)或損傷、炎癥產生的細胞因子等信號的影響下，巨噬細胞經歷經典活化并分化為M1巨噬細胞，其特征是產生炎性細胞因子，如TNFα、IL-6以及活性氧等，它們的細胞毒性使得M1巨噬細胞在清除病原體的同時引發炎癥反應，盡管這種反應對宿主具有保護作用，但持續的炎癥反應對宿主極為不利。為了保護宿主免受這種炎癥損害，巨噬細胞可被IL-4和IL-13替代激活并分化為M2巨噬細胞，產生IL-10等抗炎細胞因子，參與凋亡細胞的吞噬、炎癥消退、血管生成、組織修復與重塑等[20-21]。提示巨噬細胞極化在組織穩態、疾病發生、炎癥及其消退中發揮至關重要的作用[22]。研究[23]表明部分肝切除后，采用脂質體包裹的二氯亞甲基二磷酸鹽(Cl2MDP)選擇性耗竭KC，既可阻斷肝臟IL-6、IL-10和TNFα mRNA的合成，也可降低HGF和TGF β1 mRNA表達，延緩肝再生。最新研究表明KC內質網的Nogo-B蛋白可促進M1極化，促進酒精性肝病進展；Nogo-B缺失則可促進M2極化，促進酒精性肝病的恢復。提示KC與肝再生和損傷修復的關系極為密切[24]。

此外，目前認為M2型巨噬細胞可分為3個亞群：M2a、M2b和M2c[25]。M2a由IL-4或IL-13激活，在肝纖維化的逆轉過程發揮關鍵作用，如通過高表達的IL-10和低表達TNFα、IL-12引起免疫抑制；通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體促進HSC凋亡；通過MMP-2促進膠原降解等途徑促進ECM的降解和組織重塑[25-26]。M2b由Fcg受體、TLR或IL-1R誘導分化，是肝臟常駐的巨噬細胞類型，在正常肝臟中表達IL-1β，通過免疫復合物提高IL-1、IL-10和TNFα表達，發揮免疫調節作用，并驅動Th2細胞免疫反應[27]。M2c由IL-10誘導分化，在纖維化形成過程中，通過高表達TGFβ1和PDGF促進HSC活化增殖與膠原合成，進而促進肝纖維化的進展，并通過高表達MMP-2/-9/-12/-13降解正常ECM[26-27]。也有研究[28]認為腫瘤相關巨噬細胞可以稱作M2d巨噬細胞，主要通過促進血管生成，促進腫瘤的發展。以上研究提示，調控巨噬細胞的極化狀態對于肝損傷的修復具有重要的臨床意義。

3 Wnt信號介導纖維化肝臟巨噬細胞與肝祖細胞相互作用

近年來，再生醫學在難治性疾病領域彰顯出明顯優勢，理論上，基于干細胞移植的再生醫學擁有光明前景，但由于其安全性、成本、副作用以及體內生存能力等問題而受限。因此，近年來，干細胞移植的替代治療策略受到廣泛關注，該策略主張充分發揮內源性干細胞的功能，即通過調整干細胞的微環境，使內源性干細胞增殖并分化為組織修復所需的細胞類型，從而避免活檢、體外細胞擴增和移植等復雜過程[29]。在肝臟中，未分化但具有干細胞功能的細胞群體被稱為內源性肝祖細胞(以下簡稱為肝祖細胞)，具有分化為肝細胞或膽管上皮細胞的潛能，其分化方向取決于所處的微環境，與巨噬細胞極化狀態和Wnt信號通路活化尤為密切。

Wnt信號通路在組織再生與修復過程中發揮重要作用，其配體Wnts蛋白(Wnt1～11等)主要來源于巨噬細胞[30]。Saha等[31]研究表明，來源于巨噬細胞胞外囊泡包裹的Wnts可保護腸道干細胞，提高放射損傷后腸道干細胞的生存率，而Porcupine(PORCN)在Wnt核心配體分泌機制中不可或缺，采用PORCN抑制劑Wnt-C59消除巨噬細胞的Wnts分泌功能后，其對腸道干細胞的保護作用減弱，為Wnts來源于巨噬細胞提供了直接證據。近年來，作為干細胞微環境的重要組成部分，巨噬細胞在肝再生領域受到普遍關注[32]。

在肝纖維化進展期，肝祖細胞可向肌成纖維細胞和膽管上皮細胞分化，發揮促纖維化作用。一方面，在肝纖維化進展期，由M1巨噬細胞釋放TNFα等激活肝祖細胞的非經典Wnt信號通路(如Wnt5/frizzled2)，促進肝祖細胞向肌成纖維細胞分化[33]。在此過程中，巨噬細胞通過吞噬壞死的肝細胞或分泌CCL2/3募集CCR2+Ly6Chigh的炎性單核細胞浸潤，分泌腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducible factor of apoptosis, Tweak)，Tweak與其受體Fn14相互作用，促進肝祖細胞進一步增殖[34]。Liu等[35]研究表明，對二乙基亞硝胺誘導的大鼠肝細胞癌模型注射外源性肝祖細胞后，可促進肝纖維化的進展，可能與LPS/TLR4信號通路介導肝祖細胞向肌成纖維細胞轉化有關。筆者前期研究結果表明，在2-乙酰氨基芴(2-AAF)/CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中，肝祖細胞可向肌成纖維細胞分化，發揮促纖維化作用；體外研究表明阻斷Wnt信號通路可阻斷肝祖細胞向肌成纖維細胞分化[33]。另一方面，在肝纖維化進展期，伴隨肝實質細胞數量和功能的衰減，出現以門靜脈周圍肝祖細胞活化為特征的“膽管反應”，目前已證實新生的膽管上皮細胞可分泌TNFα、TGFβ、PDGF、IL-1、IL-6、IL-8、單核細胞趨化因子-1等多種促纖維化細胞因子，促進門靜脈周圍的成纖維細胞和HSC活化為肌成纖維細胞，合成大量的ECM，促進肝纖維化的發生與發展[36]。此外，損傷的肝細胞還可通過分泌危險相關分子模式激活祖細胞壁龕內的HSC[37]。活化的肝祖細胞還可反過來通過CCL2和CX(3)CL1等趨化因子，激活巨噬細胞分泌Tweak、調節激活正常T淋巴細胞表達和分泌細胞因子和細胞間黏附分子等途徑誘導炎癥細胞浸潤，促進肝纖維化的進展[38]。

在肝纖維化恢復期，肝祖細胞主要向肝實質細胞分化。目前已證實肝祖細胞向肝實質細胞分化過程主要由經典的Wnt/β-Catenin信號通路調控，其機制可能與M2巨噬細胞吞噬凋亡的肝細胞碎片后釋放Wnt3A，激活肝祖細胞經典Wnt/β-Catenin信號通路，促進其向肝實質細胞分化有關[39]，且Wnt3A還可促進IL-4或TGFβ1誘導的巨噬細胞M2極化[40]。臨床研究[41]表明，在兒童非酒精性脂肪性肝病，促炎巨噬細胞占主導地位，二十二碳六烯酸治療可使巨噬細胞極化為抗炎表型并上調Wnt3A表達，促進肝祖細胞β-Catenin磷酸化并使其向肝細胞分化。以上研究提示Wnt信號介導了肝臟巨噬細胞與肝祖細胞間的“對話”，基于巨噬細胞極化或Wnt信號通路的調控研究有可能成為抗肝纖維化治療的新途徑。

4 小結

綜上所述，巨噬細胞和肝祖細胞在肝纖維化發生與修復過程中發揮重要作用，巨噬細胞M1極化可分泌IL-6、IL-1、TGFβ、PDGF等，促進肝臟炎癥反應和HSC活化；并可通過釋放TNFα等激活肝祖細胞非經典Wnt信號通路，促進其向肌成纖維細胞分化。而在肝纖維化恢復期，巨噬細胞M2極化可激活肝祖細胞經典Wnt信號通路，誘導向肝實質細胞分化，促進肝纖維化修復。因此，近年來，改善肝損傷或纖維化的治療研究主要集中在肝巨噬細胞，這些干預措施主要通過調節KC的活化、炎性單核細胞遷移、巨噬細胞極化和分化等發揮作用[15]。但許多研究只是在器官層面進行免疫功能分析，并沒有明確肝臟巨噬細胞的表型。也有學者[42]認為肝纖維化恢復期的Ly6C+單核細胞具有與M1/M2不同的表型，甚至認為M1/M2定義在很大程度上不適用于肝病。因此，目前對于肝臟巨噬細胞表型轉換的潛在機制還缺乏充分的認識，未來需要對肝巨噬細胞的基因組和表型進行深入的研究，并進一步明確其調控肝祖細胞分化的機制，為肝纖維化的臨床治療提供科學依據。