腎臟去細胞和再生研究進展

黎婷

（蕪湖職業技術學院生物工程學院，安徽蕪湖241000）

0 引言

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）及其并發癥對人類和動物健康造成嚴重威脅，全球CKD成年患病率在13%左右。CKD不斷進展將導致終末期腎臟疾病，甚至其它器官功能也會衰退。CKD中腎癌的發病率和死亡率在全身腫瘤中占2%［1］，切除腎臟及其周圍組織是目前被廣泛應用于腎癌臨床治療的的一種方法，但對于單側腎、雙腎腫瘤、以及對側腎臟受損等患者來說，行切除術會造成嚴重的負面后果。腎移植可從根本上治療腎臟實質損傷，但是供體嚴重缺乏等問題很難取得實質性突破，這些問題促使了腎再生修復工程的迅速發展。一種解決方法是利用干細胞治療，研究發現，出生后哺乳動物的腎部分切除后的修復，可能是腎的干細胞遷移到受傷區域，增殖分化成體細胞，但腎的構成極為復雜，限制了臨床再生治療的發展［2］；另一種解決器官短缺的方法是使用動物器官進行異種移植，將動物器官去細胞后接種患者細胞，可避免免疫排斥反應，豬腎制成的去細胞支架，與猴及狗制成的腎支架相比，細胞的粘附性、生存和增殖效果好，但是應用到臨床腎再生治療上仍有待完善［3］。

1 組織再生學

終末期腎病患者的增多、器官供體的短缺、異種移植的臨床實施性等問題，促進了組織再生學的發展。組織再生學中重建一個新組織需要三大元素：種子細胞、支架材料和生長因子。臨床目前應用于組織工程中的支架材料分為三類：化學合成支架、天然成分支架和納米三維支架，但是存在著組織相容性和細胞粘附性差等問題。隨著再生醫學的發展，出現了全器官去細胞支架，能最大程度的保留臟器的大體形態、天然的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和超微結構，因其具有良好的生物安全性和生物相容性，以及具有細胞識別及黏附位點等優勢而被廣泛用作組織工程支架材料。完整的天然ECM，比如真皮、心包、小腸和膀胱等，已經廣泛應用于外科再建手術，因其保存了葡糖氨基聚糖類（GAGs）和纖維蛋白（如膠原蛋白、彈性蛋白和層黏連蛋白等），可維持三維立體網絡結構供種子細胞附著，并存在著一些復合生長因子，可通過信號傳遞調節基因表達來誘導調節細胞的生長、增殖、分化等［4］。ECM與種子細胞之間“動態互動”，這對腎組織的再生與修復有著重要的意義［5］。

腎的解剖結構和組成極為復雜，制備全腎去細胞支架除了保存天然立體結構外，還要保留其過濾功能的顯微結構。研究發現，腎ECM支架移植后，可促進血管發生，募集循環的祖細胞、免疫排斥性最小化，還能減少疾病傳播的風險［6］。2009年，我國劉春曉［7-8］首次制備出大鼠全腎去細胞支架；近十年來，國內外學者對全腎去細胞生物支架進行的初步細胞培養驗證了支架的組織相容性，再細胞化后檢測腎功能，為腎的再生修復工程奠定了基礎［9］。

1.1 全器官去細胞支架制備方法和影響因素

去細胞過程涉及化學、物理和酶處理過程，即使用洗滌劑、鹽、酶及物理手段，去除組織和器官中的細胞，保留ECM中的部分蛋白質，如膠原蛋白，可大大減少免疫排斥性。因此ECM接種患者的種子細胞，甚至構建一個全新器官，可將排斥的可能性降至最低。目前最簡單有效的去細胞方法就是化學灌注法，即利用洗滌劑或酸，通過破裂細胞膜和分離細胞成分去除天然細胞。常用的化學試劑如：過乙酸（去胞核效果好，對ECM結構影響極小）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，非離子洗滌劑，在心臟瓣膜去細胞殘留物最有效）、1%SDS（去除器官中央部分細胞，較Triton X-100有效）、脫氧膽酸鈉（NaDOC，陰離子去污劑，可完全去除器官的胞質蛋白）。研究發現，分別使用Triton X-100和1%SDS去除豬腎細胞，前者保留更多的纖維蛋白和生長因子，在細胞實驗中細胞的存活率、粘附性和增殖效果也更好，目前去細胞過程中多將二者結合使用，今后或可設計更有效的方法以制備質量更好的支架［4］。

為保存結構完整性，盡可能去除殘留DNA，去細胞過程中使用的方法極為重要。化學灌注的去細胞過程受器官大小、重量、厚度、細胞密度、脂類含量等因素影響，洗滌劑濃度、灌注壓力、時間、流速有所改變。研究發現，分別使用0.125、0.25、0.5和1.0%的SDS分別灌注大鼠腎臟4小時和8小時，免疫組化檢測顯示去細胞效果差異性不顯著，但0.125%的SDS灌注4小時可保留更多的生長因子。低濃度SDS恒壓灌注去細胞前，將器官冷凍或者使用滲透沖擊細胞膜，去除99%的DNA同時，能更好的保留ECM微結構，植入的種子細胞增殖速度更快［10-13］。

1.2 去細胞支架滅菌和效果評價

無論是體外、體內研究，ECM支架都要進行滅菌，以去除所有內毒素及可能的細菌和病毒DNA。常用的滅菌方法包括射線照射、環氧乙烷、酸性溶液、抗生素、乙醇或者過氧乙酸處理。酸性溶液處理會不同程度的破壞ECM微結構，也會影響再植入種子細胞的粘附性和增殖率。γ射線照射或環氧乙烷處理會改變支架微結構，損失膠原纖維和GAGs，降低種子細胞增殖率。制備腎支架過程中，常用PBS稀釋抗生素和抗真菌藥物后聯合灌注滅菌，而近期研究顯示1 M NaCl溶解0.2%過氧乙酸滅菌效果較其它方法更好［4］。

去細胞過程中纖維蛋白和生長因子都會大量減少，更好的保留ECM的微結構、纖維蛋白和生長因子的去細胞支架，植入的種子細胞生長和增殖越好。評價腎去細胞后支架ECM的三維結構，目前常用免疫組化法檢查支架ECM中腎小管、腎小球、血管的保留水平，以及去除細胞的水平（可能導致免疫排斥），用掃描電鏡檢查支架ECM中腎小球基膜的保留水平，使用原子力顯微鏡等方法檢查去細胞器官的力學水平，器官去細胞剛性降低導致坍塌。ECM中生長因子的保留水平與其生物功能相關，影響種子細胞分化成組織特異性細胞，從而影響器官去細胞后再生重構；生長因子水平也影響種子細胞的代謝活性及ECM與細胞間的互動性［14］。去細胞方法不能100%去除腎臟細胞的同時，不損傷ECM結構和蛋白成分，要求每mg干重ECM的DNA殘留量＜50 ng［15］。

1.3 腎臟再生的種子細胞

腎臟是一種復雜性器官，包含至少26種細胞，腎小體就由血管內皮細胞、系膜細胞、足細胞、壁細胞、球旁細胞、致密斑、球外系膜細胞等多種細胞構成。植入的多種種子細胞中，干細胞因其多潛能性脫穎而出，例如不論是從腎動脈，還是輸尿管灌注胚胎干細胞，都會在腎小管、血管，及腎小球中增殖，并分化成上皮和內皮細胞，但因倫理問題備受爭議［16］；髓間充質干細胞已經用于腎臟修復和再生［17］；由自身體細胞重排誘導分化得到的多潛能性干細胞，可分化成胚胎腎臟祖細胞，并在血管緊張素作用下分化成足細胞［18］。體外腎臟結構的重構，包括含有足細胞的血管化腎小球，以及管腔通暢的近端小管和遠端小管，因此種子細胞的重要性不言而喻，干細胞將在今后的腎臟再生中發揮重要作用。

2 全腎去細胞支架再細胞化

通常使用注射泵或蠕動泵，將細胞懸液勻速的經過腎動脈或者輸尿管灌注，將全身去細胞支架植入種子細胞，或通過注射器將細胞懸液均勻的注射到全腎去細胞支架的皮質區域。全腎去細胞支架再細胞化的理化性質和功能評價，包括ECM結構、細胞粘附性、細胞增殖分化和遷移情況，以及再生的腎臟功能等，例如使用免疫組化檢測ECM的立體結構（腎小球的平均直徑、腎小球毛細血管腔、動靜脈的完整性等）與細胞的粘附及遷移情況；使用免疫染色或者實時定量PCR檢測細胞增殖分化情況；使用熒光顯微鏡檢測電解質的重吸收、測定水解酶活性來監測氨基酸轉運功能、或者利用掃描電鏡、放射性核素等方法檢測腎功能［4］。

2009年開始，Ross［19-20］團隊開始進行全腎去細胞支架再細胞化的研究，通過蠕動泵灌注法植入種子細胞后，檢測到細胞活力和增殖水平好，并且從入球小動脈和腎小球分別遷移到出球小動脈和小管周的毛細血管網。2013年，Ott［21］團隊將腎臟去細胞基質支架體外聯合內皮細胞與上皮細胞培養后，成功將“新生腎臟”移植入大鼠體內，初步觀察其具有一定排尿功能。2014年，梅勁［22］團隊將全腎去細胞支架的下方1/3部分，吻合縫合至活體大鼠切除了約1/3腎下方實質組織的腎處，研究顯示祖細胞從損傷的腎組織遷徙到移植的支架中，表明支架中ECM良好的理化條件誘導了附近的腎祖細胞的增殖和分化，出現血管發生和一定的再生腎功能。但直至目前的全身去細胞支架再細胞化，遠不能達到臨床實際應用的要求。

3 展望

通過灌注法獲得含有天然ECM的全腎去細胞支架，在腎衰竭病患的腎再生和修復中具有巨大的應用前景，在3D打印之外，為腎再生醫學的治療提供了一種新的思路。進一步完善去細胞方法以保留ECM更好的理化條件、合適的種子細胞及全腎去細胞再細胞化后種子細胞的分化及更好的實現腎功能，都是今后將全腎去細胞支架再細胞化后應用到臨床移植前期需要解決的關鍵問題。