基于心肌細胞能量代謝及鈣穩態探討附子作用機制

蒲科婷，王志琪，2*，李耀偉，鄧凱文，張序晴，叢夢靜，彭 蘭，曾 嶸

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙410208；2.湖南省中藥飲片標準化及功能工程中心，湖南 長沙410208；3.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙410208；4.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

附子是中醫臨床中常用的溫陽藥物，若辨證得法、使用得當則不論對慢性疾病或是危急重癥均可取得顯著療效，然而在臨床實踐時因附子使用不當導致中毒甚至死亡的案例亦不在少數[1]。 漢代名醫張仲景擅長使用附子類方劑，將其用于治療各類虛寒疾病，究其本質在于附子可通過不同配伍、用法發揮程度不同的溫陽作用，從而發揮不同的治療作用[2]。但畏于附子之峻猛毒性，眾多臨床醫家并不能放膽使用，從而導致其不能充分發揮療效，故若能闡明附子溫陽作用的毒效關系與機制，不僅可指導其臨床安全用藥，還可為研究此類毒效并存的藥物提供思路方法[3]。

中醫陰陽學說認為人與自然界的生命都是由陰陽二氣演化而來[4]。 中醫臟腑理論認為心屬火，為陽中之陽，其主一身之血脈的功能有賴于心陽的溫煦推動作用；現代醫學認為心臟維持正常的搏血功能需要保證其有充足的能量供應及有力量有節律的收縮舒張，這與心陽之溫煦推動作用相吻合?；诖?，課題組通過文獻學習和網絡藥理學篩選發現：附子類方劑治療心衰的作用機制與調節磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated proteinkinase, AMPK）通路改善能量代謝及調節鈣調蛋白（calmodulin, CaM）改善鈣穩態有關，且AMPK 能量代謝通路及CaM 兩者之間存在關聯，故以此對附子溫心陽的相關機制加以論述。

1 附子溫心陽作用與調節AMPK 通路的關系

1.1 心衰心臟的能量代謝

現代研究認為陽氣的溫煦功能與能量代謝有關，如陽虛體質的大學生能量代謝數據，脾陽虛大鼠、腎陽虛大鼠線粒體功能研究均表明在陽虛狀態下機體能量代謝水平明顯降低[5-8]。 健康成年人的器官中能量需求最大的是心臟[9]，正常情況下，心肌細胞所需的約95%的三磷酸腺苷主要由脂肪酸和碳水化合物經線粒體分解代謝產生，另有不到5%的三磷酸腺苷來自糖酵解[10]。在心力衰竭狀態下，心肌細胞產生三磷酸腺苷的能力、對脂肪酸的攝取能力和利用率均明顯下降[11-12]；與此同時，未被利用的脂肪酸促使線粒體內膜上的解偶聯蛋白合成增多，過量的解偶聯蛋白降低了線粒體膜兩側的質子電化學梯度，阻礙了三磷酸腺苷的生成；此外，解偶聯蛋白還促進了活性氧的產生，而活性氧可進一步的引起線粒體受損；如此的惡性循環致使心肌處于能量嚴重缺乏狀態[13]。在代償機制下，心肌細胞的糖酵解和磷酸戊糖代謝有所增強，導致代謝產物乳酸的水平升高[14]，然而乳酸會損傷心肌細胞，故心肌細胞的此種代償不僅未能改善衰竭心臟的能量代謝，反而加重了心肌細胞損傷。

1.2 AMPK 通路與能量代謝的調節

AMPK 是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，由于AMPK對細胞內能量代謝情況非常敏感，常將其視為反映機體能量代謝功能的指標[15]，AMPK 通路的激活則是體內對抗并改善能量代謝不足的機制之一。細胞內三磷酸腺苷的濃度、磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）與三磷酸腺苷比值的變化均可影響AMPK 的激活[16]，進而使其調節細胞能量代謝。

心衰時，心肌細胞所產生的三磷酸腺苷不足，AMPK 通路被激活并通過多種途徑提高了細胞對能量代謝底物脂肪酸與葡萄糖的攝取和利用，促進細胞內糖原的分解等，從而增加了心肌細胞內的三磷酸腺苷?；罨腁MPK 調節細胞能量代謝的具體作用環節有增加脂肪酸轉運體FAT/CD36 和膜相關脂肪酸結合蛋白FABPpm 的蛋白表達和質膜含量[17]，升高細胞內葡萄糖轉運體GLUT4 的水平并促進其向心肌細胞膜移位[18]；抑制糖原合成酶活性并增強糖原磷酸化酶活性，以此調節細胞內的糖原合成改善糖代謝[19]；增加磷酸果糖激酶的表達[20]。

除了對細胞能量代謝底物進行調節，AMPK 還可減少活性氧的產生從而緩解其對線粒體的損傷[21]，提高細胞內線粒體的數量、促進線粒體DNA 的復制和轉錄等以改善心肌細胞內能量代謝。其中后者的機制比較復雜，主要涉及過氧化物酶體增殖物受體共激活因子1α（peroxisome proliferators-ctivatedrecep tors co-activator, PGC-1α） 和線粒體轉錄因子A（mito chondrial transcription factor A, mtTFA）。 其 中，PGC-1α 既可調節線粒體的氧化代謝，亦可調控線粒體的基因表達，而mtTFA 的主要功能為調控線粒體的合成。心肌細胞內活化的AMPK，以磷酸化的方式激活PGC-1α，激活的PGC-1α 與細胞核呼吸因子1（nucleus respiratory factor 1, NRF1）、細胞核呼吸因子2（NRF2）及ERRA 轉錄因子發生相互作用，從而激活mtTFA，最終增加線粒體的轉錄與合成[22]；心肌細胞內磷酸腺苷/三磷酸腺苷比值增大也可激活AMPK，被活化的AMPK 促進了細胞內尼克酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase, Nampt）的表達，進而提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平，使得沉默信息調節因子1（silent information regulator 1, SIRT1）被激活，活化的SIRT1 以脫乙?；磻せ頟GC-1α，AMPK 通過此途徑也可促進線粒體的轉錄合成[23]。

1.3 附子作用于AMPK 通路以改善心肌能量代謝

近期，有學者從AMPK 通路研究了附子對能量代謝影響。其中，LU 等[24]研究表明干姜附子水煎液既可明顯促進心衰大鼠心肌細胞中SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2 4 種蛋白mRNA 的表達，還可明顯提高大鼠心肌細胞內SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2蛋白的含量，因此，干姜附子配伍改善心功能可能是通過調節AMPK 通路改善心肌細胞中線粒體的功能實現的。DENG 等[25]的研究認為附子中的苯甲酰烏頭堿可能是其調節AMPK 通路的主要活性物質，實驗發現BAC 可增強小鼠耗氧量，促進小鼠肝細胞、心肌細胞和骨骼肌細胞中線粒體mtDNA 的復制，增加三磷酸腺苷的生成；苯甲酰烏頭堿還能提高線粒體中AMPKα、PGC-1α、NRF1 等與AMPK 通路相關蛋白的表達。 上述研究成果提示，附子溫心陽作用與調節AMPK 通路改善能量代謝的作用直接相關，可以此為基礎開展更深入的探究。

2 附子溫心陽作用與改善鈣穩態的關系

2.1 心肌的舒縮與鈣穩態

中醫學認為心主一身之血脈，而心臟推動全身血液運行，有賴于其有力量有節律的搏動；生理學認為心臟能夠正常的舒張收縮的基礎是心肌細胞正常的興奮性。 中醫學心陽虛證一般被認為與現代醫學中的急慢性心力衰竭的主要癥狀比較相似，心衰時心臟搏血力量不足且往往伴隨心律失常[26]。 而鈣離子對心肌細胞興奮性具有重要作用，故心肌細胞內鈣穩態及其變化與心臟之推動功能可能密切相關，如若心肌細胞內鈣穩態被破壞，心臟功能也將受到影響。

在多種門控蛋白的配合下，心肌細胞中的鈣離子濃度能夠維持正常的動態變化，以完成心肌正常的收縮-舒張。肌漿網是存儲Ca2+的主要細胞器，心臟收縮初期所需92%的鈣離子由其提供[27]。其調節鈣離子濃度的具體途徑為：當心肌細胞興奮時，心肌細胞膜上的L 型Ca2+通道（LTCC）開放，細胞外少量Ca2+經LTCC 進入細胞，進而激活肌漿網的蘭尼堿受體鈣釋放通道（ryandine receptor calcium release channel, RyRs），引起其發生“鈣致鈣”釋放；釋放進入胞質的Ca2+與肌鈣蛋白結合，伴隨消耗一定量的三磷酸腺苷，引起心肌收縮[28]；在心肌興奮-收縮完成后，心肌細胞內的Ca2+主要由肌漿網鈣泵及Ca2+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶將其從胞漿內轉入至肌漿網再次儲存；細胞內的Ca2+還可在鈉鈣交換體（sodium-calcium exchanger, NCX）和Na+-K+-ATP 酶的配合下以“一鈣出，三鈉進”的方式轉出[29]，當心肌細胞內的鈣離子濃度降至7～10 mol/L 時，心肌細胞舒張，但是無論心肌收縮或舒張均需消耗三磷酸腺苷。

2.2 鈣調磷酸酶與鈣穩態

鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/camodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ）是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是CaM家族中重要的一員。在正常的心肌細胞中，70%的鈣離子由肌漿網重新攝取，剩余的30%由NCX 轉出細胞外[30]?；罨腃aMKⅡ可直接磷酸化肌漿網鈣泵導致肌漿網回攝鈣離子的能力下降低，還可磷酸化NCX1使其不能將鈣離子轉出細胞，以致心肌細胞內鈣超載，鈣穩態被破壞，導致心肌收縮舒張的時間延長，心肌收縮力不足，最終引發或加重心衰。

CaMKⅡ的結構中的結構域部分共有4 個Ca2+結合位點，其中2 個位點被占據，只有當心肌細胞內游離的鈣離子濃度增高時，升高的鈣離子方能與其余2個Ca2+結合位點結合[31]，繼而激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ可通過磷酸化多種CaM，包括LTCC、RyRs、NCX 等，影響鈣穩態的調節。如激活的CaMKⅡ可再次開放LTCC 引發鈣超載[30]，還可減少RyR2 的關閉量，使原本儲存于肌漿網的鈣離子大量外流[32]。

2.3 附子對CaM 的作用

近年來，關于附子調節CaM 的研究逐漸增加，研究表明附子苷促進大鼠心臟中CaM 的作用與藥量呈正相關[33]；附子可糾正陽虛大鼠鈣調蛋白的表達，提示附子溫陽作用與調節鈣調蛋白有關[34]；而高劑量的附子則可增強其心臟中CaMKⅡ的表達并加重大鼠心衰[35]。對附子主要活性成分烏頭堿的深入研究則顯示，烏頭堿可促進大鼠心室肌細胞膜上LTCC開放，引起鈣超載，最終導致心律失常[36]；烏頭堿所引發的鈣瞬變幅度降低而頻率增加效應與其劑量呈正相關，且可通過下調肌漿網鈣泵、上調RyR2 的表達引起鈣超載[37]；附子中的另一成分次烏頭堿可促進心肌細胞LTCC 和RyR2 mRNA 的表達，導致鈣超載，繼而誘發心律失常[38]。

3 附子對心臟及AMPK、CaM 的作用

以上論述表明，心陽之溫煦推動作用與心肌細胞線粒體的能量代謝及鈣穩態密切相關，而線粒體的功能與鈣穩態調節之間存在著密切聯系：一方面，維持鈣穩態需要充足的三磷酸腺苷；另一方面，心肌細胞內的鈣穩態是心肌細胞線粒體生成三磷酸腺苷的前提，同時線粒體可吸收胞漿內游離的Ca2+以緩沖心肌細胞內過高的Ca2+[39]。

胞漿中的Ca2+要進入線粒體，必須經線粒體上的鈣單向轉運復合體（mitochondrial calciumuniporter，MCU）轉運，而只有高濃度的Ca2+才能激活該通道。MCU 由必要的線粒體Ca2+單向轉運復合體調節器、線粒體Ca2+攝取器1（mitochondrial calciumuptake one,MICU1）和線粒體Ca2+攝取器2（MICU2）組成[40]。 因此，當胞質內Ca2+濃度增加時，MCU 開放增加，促使線粒體吸收游離的Ca2+以調節鈣穩態；但當Ca2+濃度過高時，則會破壞線粒體內部的鈣穩態，繼而損傷線粒體的結構及功能[41]。而當能量代謝不足時，線粒體內產生的活性氧又會直接或間接地促進Ca2+內流；可見心肌細胞的鈣穩態及線粒體內的鈣穩態和線粒體的功能之間存在密切聯系。

實驗研究發現，烏頭堿配伍甘草次酸可顯著降低心肌細胞烏頭堿中毒所致的RyR2 過表達， 同時增加NCX1 的表達，緩解細胞內鈣超載，并通過調控心肌細胞膜L 型電壓門控鈣通道蛋白的表達，增強心肌細胞的收縮功能[42]；附子煎液可降低線粒體膜電位，增加細胞內活性氧含量，破壞線粒體功能，并可抑制PGC1-α 的表達，從而降低線粒體緩沖細胞內Ca2+濃度的作用[43]；而干姜附子湯在改善心衰的同時可上調MCU、MICU1、MICU2 蛋白的表達，提示其治療心衰的作用可能與調控MCU 改善線粒體功能有關[44]；參附注射液可改善心衰大鼠心肌細胞內線粒體結構及功能，增加三磷酸腺苷產量，還可增加衰竭心肌細胞的肌漿網鈣儲量、降低胞質內鈣離子濃度，間接增強心肌細胞收縮力，促進心衰大鼠心功能的恢復[45]。上述實驗及結果提示，附子溫心陽作用機制可能與改善線粒體功能及調節鈣穩態相關，且兩者之間存在聯系。

綜上所述，心陽之盛衰與心肌細胞能量代謝及鈣穩態相關，而線粒體功能是聯系細胞能量代謝和鈣穩態的一個樞紐，因此，可以調控線粒體與胞質內鈣離子濃度變化的關鍵通路MCU 為切入點，將AMPK-CaM 通路相結合探究附子的溫陽作用及其毒效關系，通過檢測MCU、MICU1、MICU2 的表達并與線粒體及胞質內鈣離子濃度變化相聯系，有望表征附子溫心陽的毒與效。

4 小結

由于中醫學陽氣概念是對人體多種功能宏觀整體的概括，而附子的溫陽功效亦是對多途徑多靶點整體調節作用的概括，且中藥的藥效是以辨證論治為基礎，故在研究時應以附子及其配伍組合的整體藥效為研究對象，以多通路多靶點結合的方式對其進行研究，如此可更加貼合中醫藥之整體觀念，再以中醫辨證論治思想為指導，通過對比其對不同證型下心臟或心肌細胞的作用，可更加全面的說明其毒與效，故以AMPK-CaM 通路結合研究附子溫心陽作用機制并探索其毒效關系，或可更加接近其作用本質。