HBV cccDNA轉錄代謝調控機制及沉默清除策略

宰文靜， 陳捷亮， 袁正宏

復旦大學上海醫(yī)學院， 基礎醫(yī)學院病原生物學系， 醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)健委重點實驗室， 上海 200032

HBV持續(xù)感染所致慢性乙型肝炎(CHB)嚴重危害人類健康。每年全球約有60萬人死于HBV感染相關肝硬化、肝衰竭以及原發(fā)性肝癌等疾病。目前臨床上的治療藥物包括干擾素(IFN)和核苷(酸)類似物(NAs)，可有效抑制HBV轉錄或復制，但無法徹底清除HBV，且存在治療響應率低或抗原陰轉率低等問題，難以實現(xiàn)乙型肝炎治愈[1]。

HBV cccDNA作為HBV關鍵復制中間體及其轉錄復制模板，經(jīng)由HBV從頭感染和胞內(nèi)復制回補兩種途徑形成，在感染肝細胞的細胞核內(nèi)蓄積為cccDNA池，其持續(xù)存留是乙型肝炎慢性化和難以治愈的關鍵。現(xiàn)階段研發(fā)的抗-HBV藥物靶向HBV生命周期多個環(huán)節(jié)，包括入胞抑制劑、HBsAg抑制劑、衣殼蛋白(HBc)組裝調節(jié)劑(CpAM)、HBV聚合酶(Pol)抑制劑、HBV X蛋白(hepatitis X protein，HBx)靶向藥物、RNA干擾技術靶向HBV RNA等。其中入胞抑制劑和NAs等理論上可通過有效阻斷肝細胞發(fā)生再感染及病毒復制從而切斷cccDNA生成途徑，但對于肝細胞核內(nèi)既有cccDNA池，目前尚缺少針對性的有效治療手段。

基于HBV cccDNA持續(xù)沉默是CHB“功能性治愈”的目標，深入了解cccDNA相關調控機制并尋找靶向策略是研究重點和核心任務。本文簡單介紹cccDNA基本生物學特性，重點回顧目前對其轉錄和代謝調控機制及相關宿主因子的認知，并對cccDNA沉默清除的可能途徑和靶向調控策略進行討論。

1 HBV cccDNA生成與代謝機制及特性

HBV cccDNA經(jīng)由松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)修復及回補途徑形成，具體環(huán)節(jié)包括：去除與負鏈DNA 5′端共價結合的Pol以及5′-flap、去除正鏈DNA 5′端RNA引物和補齊并連接滯后鏈的缺口。去除與rcDNA共價結合的Pol形成去蛋白的rcDNA中間體是cccDNA形成的關鍵步驟，該過程可能由酪氨酸-DNA磷酸二酯酶2參與調節(jié)[2]。Flap內(nèi)切酶1是一種flap結構特異性的核酸內(nèi)切酶，可能參與rcDNA負鏈DNA 5′-flap以及正鏈DNA上RNA 引物的去除[3]。其他參與cccDNA形成的因子還包括Polκ、Polα等宿主DNA聚合酶、DNA連接酶Ⅰ/Ⅱ以及DNA拓補異構酶Ⅰ/Ⅱ等。近期一項體外生化系統(tǒng)的研究[4]提示，HBV cccDNA的形成至少需要包括人增殖細胞核抗原、復制因子C復合物、Polδ、flap內(nèi)切酶1和ATP依賴性DNA連接酶Ⅰ 5個因子參與。

已有研究[5]表明，每個感染肝細胞內(nèi)cccDNA拷貝數(shù)在1至幾百之間不等且存在波動，平均約1.05個拷貝。cccDNA池的蓄積受限于病毒在細胞內(nèi)復制和回補的效率，其受宿主和病毒因子嚴格控制。HBV大胞膜蛋白S缺失可促進核內(nèi)cccDNA數(shù)量增加，此外，宿主固有免疫識別病毒核酸亦被報道參與cccDNA池的動態(tài)調節(jié)[6]。研究[7]表明，cccDNA伴隨CHB感染的整個自然史，即使發(fā)生抗原血清轉換或急性感染轉歸患者體內(nèi)也存在少量cccDNA。抗病毒治療理論上推測可通過阻斷cccDNA新生而逐步耗竭或通過恢復免疫以間接降低cccDNA含量，但臨床研究[8]表明很難徹底清除cccDNA。有數(shù)學模型推算體內(nèi)NAs持續(xù)治療下完全清除肝內(nèi)cccDNA至少需15年[9]。

盡管如此，體外研究[10]表明HBV cccDNA半衰期約35～57 d；近期一項研究[11]通過測定抗病毒治療中患者血清HBV RNA耐藥突變LAMR(rtM204V)以動態(tài)反應肝內(nèi)cccDNA池的更新速度，結果提示肝內(nèi)cccDNA更新速率約5.6～11.1周，遠快于之前估計的數(shù)十年。上述研究提示有可能通過cccDNA耗竭的方式實現(xiàn)cccDNA的降解清除。

2 HBV cccDNA轉錄調控機制及相關宿主因子

已有研究[12]表明通過與宿主組蛋白、非組蛋白及病毒結構蛋白core等結合，HBV cccDNA可進一步組裝成微染色體。與EB病毒、卡波氏肉瘤相關皰疹病毒等DNA病毒episome在細胞核內(nèi)易形成異染色質樣狀態(tài)不同，HBV cccDNA微染色體的轉錄往往較為活躍，存在持續(xù)病毒抗原表達和病毒復制[13]。高分辨率染色質構象捕獲技術(Hi-C)研究[14]結果顯示，HBV cccDNA在細胞核內(nèi)主要分布于常染色質附近，且趨向于分布在富含Cfp1的CpG島附近，從而有利于其自身轉錄復制。HBV cccDNA本身也包含3個CpG島(CpG島Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ)，其DNA甲基化狀態(tài)參與調控HBV轉錄復制。宿主DNA甲基轉移酶1/2/3可通過促進病毒DNA甲基化修飾參與cccDNA轉錄調控[15]。

現(xiàn)有研究提示，cccDNA轉錄受宿主因子和病毒蛋白的雙重調控。研究[16]表明，HBV基因組包含多個轉錄因子及核受體結合位點，主要包括增強子Ⅰ、增強子Ⅱ以及核心啟動子區(qū)域。肝特異性轉錄因子HNF1/3/4以及核受體過氧化物酶體增殖物激活受體α-維甲酸X受體α、法尼醇X受體等均可識別并調控核心啟動子轉錄。cAMP反應元件(CRE)結合蛋白(CREB)可識別HBV增強子Ⅰ區(qū)域HBV-CRE保守序列并介導肝特異性病毒轉錄[17]。宿主RNA Pol Ⅱ可識別cccDNA上順式作用元件，介導HBV基因組轉錄[18]。其他轉錄因子包括ATF、YY1、SP1、AP1、TBP等以及轉錄共激活因子如CRTC1、C/EBP、p300/CBP等也均被證明參與cccDNA的轉錄調節(jié)。

另外，cccDNA轉錄狀態(tài)可能與其上結合組蛋白H3/H4的表觀修飾狀態(tài)有關。體外HBV感染細胞染色質免疫共沉淀技術(chromatin immunoprecipitation,ChIP)-seq實驗[19]結果表明，cccDNA上組蛋白大多為活化性位點修飾(H3K4me3、H3K27ac和H3K122ac)，且主要分布在啟動子區(qū)域，缺少抑制性組蛋白修飾。針對CHB臨床患者肝穿組織ChIP-seq研究[20]發(fā)現(xiàn)，cccDNA表觀修飾狀態(tài)存在異質性，可能與肝內(nèi)病理狀態(tài)及免疫抑制情況有關。表觀調控因子通過調節(jié)cccDNA上組蛋白甲基化、乙酰化等修飾參與調節(jié)cccDNA轉錄活性，包括轉錄活躍(“開放”)和轉錄抑制(“關閉”)兩種狀態(tài)。本課題組前期研究[21]發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉移酶PRMT5可通過促進cccDNA上H4R3甲基化修飾(H4R3me2)表觀調控cccDNA的轉錄活性，同時可與HBc以及Brg1依賴的hSWI/SNF染色質重塑子共同作用，抑制RNA Pol Ⅱ與cccDNA結合，從而抑制cccDNA轉錄。還有研究[22]表明組蛋白去乙酰化酶SIRT3通過與SUV39H1共同作用抑制SETD1A募集從而促進H3K9甲基化修飾(H3K9me3)并降低H3K4甲基化水平(H3K4me3)，由此減少cccDNA上RNA Pol Ⅱ和轉錄因子YY1結合并限制cccDNA轉錄。其他宿主因子包括HDAC1、EZH2、PRMT1、SIRT1、SETDB1、PCAF/GCN5等也被報道參與HBV cccDNA表觀及轉錄調控。

3 HBV cccDNA沉默途徑及策略

3.1 宿主限制因子 研究表明，病毒感染過程中病毒與宿主之間存在多種相互作用，與病毒的維持復制和致病密切相關，同時宿主細胞內(nèi)也存在多種拮抗機制抑制病毒轉錄或復制，相關的宿主蛋白稱為“限制因子”(antiviral restriction factor, ARF)。ARF作為固有免疫系統(tǒng)的一部分，在多種病毒領域被廣泛研究。其主要的特征包括：(1)具有抗病毒功能效應；(2)通常由IFN或病毒感染所誘生；(3)可被病毒蛋白拮抗；(4)具有基因突變率高(“positive selection”)的遺傳學特征；(5)無病毒感染時其細胞內(nèi)表達水平受嚴格調控；(6)某些情況下其在細胞內(nèi)持續(xù)表達。部分ARF特異性針對特定類型的病毒，部分則具有廣譜的抗病毒效應[23]。目前已有多種針對HBV的宿主限制因子被鑒定，包括SMC5/6、Mx2、APOBEC3C、TRIM22、ZAP、SAMHD1、Myd88等，但直接針對cccDNA的較少。IFN誘生基因Mx2可以通過抑制HBV RNA轉錄以及病毒復制發(fā)揮抗HBV效應，其也可通過抑制回補的方式降低感染肝細胞內(nèi)cccDNA的含量[24]。鋅指蛋白ZAP可識別HBV前基因組RNA末端冗余序列(nt 1820-1918)并促進HBV RNA轉錄后降解[25]。其他一些轉錄因子和表觀調控因子如NF-κB、STAT1/2、PROX1、SETDB1、ZHX2、DDX3等也被發(fā)現(xiàn)作為HBV宿主限制因子，可直接或間接導致HBV轉錄抑制或沉默。進一步篩選、鑒定HBV cccDNA特異性宿主限制因子可能為開發(fā)新型抗-HBV藥物提供新的靶點及策略。

3.2 表觀沉默 鑒于cccDNA轉錄活性受表觀因子調控，通過表觀調控可能使轉錄活躍的cccDNA轉變?yōu)榉腔顒愚D錄狀態(tài)，從而實現(xiàn)CHB功能性治愈。IFN可通過改變cccDNA的表觀修飾狀態(tài)發(fā)揮對cccDNA轉錄復制的抑制，而對cccDNA直接清除降解的效應較弱。研究[26-27]表明，IFNα對HBV轉錄復制的抑制與其減少STAT1和STAT2復合物在cccDNA上結合、以及減少cccDNA微染色體上活化性組蛋白乙酰化修飾(H3K9ac、H3K27ac)有關；此外，IFNα還可通過招募其他轉錄調節(jié)因子包括轉錄抑制復合物PRC2(YY1和EZH2)、HDAC1和hSirt1等因子與cccDNA結合，從而表觀抑制cccDNA轉錄。其他細胞因子如IL-6、IL-1β等也被報道具有類似效應。IL-6可以使cccDNA上組蛋白乙酰化減少及轉錄因子HNF1α、HNF4α結合減少，并促使STAT3從cccDNA重新分布至宿主靶基因，從而表觀沉默cccDNA[28]。利用現(xiàn)有的表觀調節(jié)劑可能有利于HBV cccDNA直接靶向沉默治療，從而減輕HBV感染所致肝臟病理損害或可部分恢復宿主免疫。例如，HDAC1抑制劑被證明可以通過直接靶向cccDNA轉錄所需宿主因子包括HDACs抑制鴨HBV cccDNA轉錄，但該效應在不同的細胞模型中尚存在爭議[27]。然而已鑒定的cccDNA表觀調控因子往往對宿主基因也具有廣泛調控作用，如何篩選、鑒定HBV cccDNA特異性的表觀調控靶點仍有待解決。此外需關注，表觀調控的手段僅能實現(xiàn)cccDNA的轉錄沉默而不能降解清除cccDNA，特定情況下如抗腫瘤藥物或免疫抑制劑治療期間可能會導致HBV的再激活[29]。

3.3 靶向病毒蛋白HBx和HBc 已知，病毒蛋白HBx和HBc在參與cccDNA微染色體結構組裝、轉錄表觀調控以及細胞內(nèi)穩(wěn)定維持等方面均發(fā)揮重要作用，其中HBx可以通過與多種宿主因子直接作用并招募其結合至cccDNA微染色體上，從而有利于病毒自身的轉錄復制。例如，HBx作為cccDNA轉錄共激活因子，可促進CREB二聚化及轉錄共激活因子CRTC1、p300/CBP等募集激活cccDNA轉錄[30]。HBx也可通過招募p300/CBP、PCAF/GCN5抑制HDAC1、SIRT1等表觀因子與cccDNA結合并促進cccDNA上H3/H4乙酰化修飾，正向調控cccDNA轉錄活性[31]。此外，HBx可通過多種途徑拮抗宿主限制因子。例如，SMC5/6可以與HBV cccDNA結合并抑制cccDNA轉錄，HBx被證明可以通過劫持宿主CRL4 E3連接酶系統(tǒng)促進SMC5/6經(jīng)蛋白酶體途徑降解，從而有利于cccDNA轉錄[32]。通過藥物靶向HBx，可能有利于降低cccDNA轉錄活性或使其表觀沉默，同時解除HBx對宿主限制因子的降解作用，促進cccDNA的沉默或清除。廣譜性抗感染藥物硝唑尼特(NTZ)被報道可阻斷HBx-DDB1復合物形成。進一步通過高通量藥物篩選、設計抗體等方式尋找靶向HBx的藥物可能有助于實現(xiàn)乙型肝炎功能性治愈。病毒核心蛋白HBc/core與cccDNA直接結合，使微染色體結構更致密，其核小體間距較宿主染色體縮短10%，可能與cccDNA穩(wěn)定維持相關。HBc可通過與cccDNA上富含CpG區(qū)域結合促進cccDNA轉錄。研究[33]表明，HBc可介導APOBEC3A/B結合至cccDNA并導致cccDNA脫氨基及降解。CpAM可阻止核衣殼的組裝或促進結構異常的核衣殼裝配，可有效抑制HBV DNA水平并阻止rcDNA形成cccDNA；同時可能導致既有cccDNA結構功能異常或抑制其轉錄[34]。當前已有部分CpAM類藥物正在進行二期臨床評價，其與NAs聯(lián)合使用是否具有協(xié)同抗病毒效應有待進一步觀察研究。

4 HBV cccDNA清除途徑及策略

4.1 非殺細胞清除cccDNA 研究[35]表明，急性乙型肝炎感染轉歸的過程中，存在非殺細胞清除cccDNA的現(xiàn)象。在HBV轉基因小鼠中輸入HBsAg特異性CD8+殺傷性T淋巴細胞(CTL)可以顯著降低肝細胞內(nèi)HBV轉錄及復制，同時HBcAg陽性細胞的比例由75%降低至約為0，而發(fā)生肝損傷的程度顯著低于清除所有感染細胞所需殺傷的肝細胞數(shù)，提示CTL可能通過非殺細胞的方式促進HBV RNA及DNA的清除。對HBV急性感染黑猩猩中HBV清除與肝損傷的動態(tài)觀察[36]結果顯示，黑猩猩肝內(nèi)HBV DNA及cccDNA的急性清除發(fā)生在CTL浸潤之后、肝損傷發(fā)生之前，提示CTL分泌的細胞因子及其下游的調節(jié)因子可能介導了cccDNA的降解或清除。IFNγ、TNFα作為CTL分泌的細胞因子，已被證實可以通過非殺細胞的方式促進小鼠模型中HBV DNA以及cccDNA的清除[37]。采用IFNγ及TNFα單克隆抗體處理HBV轉基因小鼠可以阻斷輸入的HBsAg特異性CTL對HBV RNA和HBV DNA的非殺細胞清除效應[38]。APOBEC家族蛋白作為IFN誘生基因，被報道可能是非殺細胞清除cccDNA中的關鍵介導因子[39]。高劑量IFNα或LTβR激動劑誘生的APOBEC3A/3B(A3A/A3B)可以與病毒蛋白core相互作用并被募集至cccDNA上，通過誘導cccDNA負鏈脫氨基作用促進cccDNA的降解，但仍存在爭議。可以說介導非殺細胞清除cccDNA的關鍵通路和效應因子仍不明確，如何研究并揭示相關機制并用于HBV cccDNA靶向清除是亟需解決的問題。

4.2 殺細胞清除感染肝細胞 除了非殺細胞清除cccDNA之外，免疫介導的對感染肝細胞的殺傷是cccDNA清除的另一關鍵途徑。研究[40]表明，急性感染恢復時期，CTL是介導HBV清除的主要效應細胞。然而在CHB患者體內(nèi)往往存在T淋巴細胞功能紊亂或功能性耗竭。HBV特異性免疫功能紊亂是乙型肝炎慢性化的主要原因之一，可能與抑制性的細胞因子如IL-10分泌、免疫檢查點PD-1/PD-L1表達上調以及外周長期病毒抗原刺激導致T淋巴細胞疲勞或功能紊亂有關[41]。開發(fā)調節(jié)HBV特異性細胞免疫反應的治療方法有利于免疫控制HBV感染，從而實現(xiàn)乙型肝炎“功能性治愈”。現(xiàn)有的免疫調節(jié)手段包括應用模式識別受體激動劑如TLRs激動劑和RIG-Ⅰ激動劑、阻斷免疫檢查點的抗體如使用抗PD-1/PD-L1從而恢復HBV特異性CTL功能、研發(fā)治療性疫苗(HBsAg/PreS、HBcAg等蛋白疫苗、DNA疫苗以及病毒載體疫苗等)、采用基因編輯技術制備HBV特異性CAR-T或TCR-T細胞并回輸至患者體內(nèi)等[42]。此外，通過抗病毒藥物或特異性抗體降低患者體內(nèi)HBV抗原表達也有利于部分緩解T淋巴細胞功能耗竭的情況。通過免疫調節(jié)恢復T淋巴細胞功能可能實現(xiàn)乙型肝炎治愈，存在的風險是可能導致嚴重的肝損傷甚至急性肝衰竭。

4.3 肝細胞自我更新、cccDNA分裂丟失 HBV cccDNA盡管在非分裂肝細胞中非常穩(wěn)定，但在肝細胞分裂過程中其含量會快速降低[43]，其可能機制包括：(1)cccDNA不能通過滾環(huán)復制的方式隨宿主染色質復制；(2)與EB病毒、卡波氏肉瘤相關皰疹病毒、人乳頭瘤病毒等DNA病毒可通過編碼蛋白將病毒episome錨定在宿主染色質上[44]不同，cccDNA無類似功能病毒蛋白，因而導致其在細胞分裂過程中易被丟失或稀釋。HBV急性感染恢復時期存在肝臟自我修復、肝細胞分裂更新，研究[45-46]證實該過程伴隨著cccDNA含量的顯著降低。在CHB治療過程中需注意的是，為保證肝細胞分裂過程中新生的肝細胞不被HBV再次感染和進行HBV復制，采用HBV入胞抑制劑或NAs可能是一種策略[47]。

4.4 基因編輯工具靶向HBV cccDNA 基因編輯工具包括ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas9等均被證明可以靶向編輯HBV cccDNA。通過誘導插入或缺失突變導致HBV蛋白表達異常、從而影響病毒復制，其也可以通過誘導部分cccDNA的降解實現(xiàn)HBV cccDNA的清除[48-49]。但其應用于臨床治療仍然存在很大的安全和技術問題，包括如何避免脫靶效應以及如何將基因編輯工具靶向遞送至感染肝細胞。此外，通過基因編輯工具使HBV cccDNA線性化后可能會導致HBV整合的概率增加；切割后的cccDNA往往會被宿主DNA修復機制修復后重新環(huán)化，由此可能會導致HBV cccDNA突變和耐藥[50]。

5 展望

近年來，新的高通量測序及篩選技術手段不斷涌現(xiàn)，可能為乙型肝炎治愈相關研究和實現(xiàn)精準化治療提供了新的技術手段和策略。全基因組篩選包括siRNA文庫、shRNA文庫以及CRISPR/Cas9文庫篩選技術作為高通量鑒定特定功能蛋白的有效工具，可用于HBV cccDNA靶向沉默或降解清除的宿主因子篩選。單細胞測序、定量蛋白質組學研究病毒蛋白、核酸與宿主細胞之間相互作用關系，可能有利于揭示病毒感染建立關鍵介導因子及病毒與宿主細胞相互拮抗機制，為抗病毒治療提供新的靶點。其他技術手段包括多組學聯(lián)合分析臨床標本隊列、以及結合傳統(tǒng)的“Pull-down”、ChIP及蛋白質譜或基因測序技術鑒定特定蛋白-蛋白/DNA/RNA相互作用，可有利于尋找cccDNA特異性結合或轉錄調控因子。體外生化系統(tǒng)的建立也有助于加深對cccDNA生物學特性的了解及相關宿主因子鑒定。高通量化合物篩選靶向病毒蛋白HBx、HBc或直接靶向cccDNA的分子可為抗病毒治療提供新的候選藥物及治療靶點。針對不同篩選策略構建相應的細胞模型是能否篩選成功的關鍵，例如可能需要相應的帶有報告基因的重組cccDNA細胞模型；對HBV感染建立過程中病毒與宿主蛋白相互作用的研究，需要利用可支持HBV長期、高效、穩(wěn)定感染的細胞模型如5C-PHH細胞模型；鑒定與cccDNA特異性結合或靶向調控的宿主因子，嘗試體外重構并標記cccDNA可能是較為合適的手段。總之，隨著對cccDNA生物學特性及轉錄和代謝調控機制認識的逐步加深，將為研發(fā)沉默清除cccDNA的新型抗病毒治療策略提供堅實的基礎，以期最終實現(xiàn)乙型肝炎治愈。