HBV持續感染及其機制的研究進展

陳 歡，楊燕卿，儲 君，張國遠，林世德

遵義醫科大學附屬醫院 感染科，貴州 遵義 563003

根據2016年全球疾病負擔研究報告，每年高達80萬患者死于HBV感染和其所致的終末期肝病(肝硬化、肝衰竭、肝癌等)[1-2]。目前批準用于治療慢性乙型肝炎的藥物包括干擾素和核苷(酸)類似物。由于干擾素治療的副作用，只有一小部分慢性乙型肝炎符合其使用指征，且療效有限，干擾素治療后不到10%的患者能實現持續HBsAg陰轉[2-3]。核苷(酸)類似物治療的耐受性較好，可以明顯降低HBV載量，但其對HBsAg血清學轉換影響不大，且在停止治療后存在病毒反彈、肝炎復發、肝衰竭、失代償，甚至死亡的風險，故大多數患者需要長期口服抗病毒藥物維持治療[4-5]。經治療后達到病毒抑制或已治愈的急性或慢性乙型肝炎患者，在接受免疫抑制治療或免疫力低下的情況下，HBV可發生再活化，這表明該病毒并沒有徹底被消滅[3]。基于這一現狀，迫切需要認識HBV持續感染的機制，以實現慢性乙型肝炎治療上的突破。

HBV屬嗜肝DNA病毒科，大小約3.2 kb，其感染肝細胞后，在細胞核內釋放松弛環狀DNA(relax circular DNA，rcDNA)，rcDNA經過某種修復機制，修復正鏈轉變成共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)[5]。細胞RNA聚合酶Ⅱ以cccDNA 負鏈(包含4個開放讀碼框，即S、C、P、X區)為模板，轉錄產生4種mRNA，大小分別為3.5、2.4、2.1和0.7 kb，其中3.5 kb mRNA又稱為前基因組RNA(pregenome RNA，pgRNA)。mRNAs從細胞核移至細胞質，翻譯成HBcAg、HBeAg、病毒DNA聚合酶、HBsAg、HBx蛋白，也可組裝形成成熟的病毒衣殼。成熟的病毒衣殼可經過包膜蛋白包裹，以病毒顆粒的形式分泌到細胞外，也可再次進入細胞核以補充或擴增cccDNA池[4-5]。這些HBV病毒組分、病毒顆粒及cccDNA是HBV生命周期中的產物，可作用于自身，同時又可與宿主相互作用，促進HBV的復制，負向調節免疫功能，引起HBV慢性感染，促進疾病的進展。下面將闡述cccDNA、HBV顆粒及病毒蛋白成分維持HBV持續感染的相關研究進展。

1 cccDNA與HBV持續感染

cccDNA是HBV復制周期的一個關鍵復制中間體，在細胞核內與細胞組蛋白和非組蛋白形成一個微型染色體。它不包含復制起點，不能在受感染的肝細胞中自我復制。理論上cccDNA應隨著細胞分裂而丟失，然而，盡管誘導細胞分裂后cccDNA顯著減少，但通過cccDNA的不斷補充，及其在細胞核中的穩定性，使cccDNA在細胞核中仍持續存在[6]。到目前為止，已經確定了3種補充cccDNA的途徑：病毒顆粒通過與肝細胞上的鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白受體結合，感染肝細胞，這是cccDNA生成的典型途徑；第2條途徑是細胞質中HBcAg的富精氨酸碳端域觸發含rcDNA的衣殼進入細胞核，rcDNA通過細胞內途徑轉化為cccDNA；第3條途徑是肝細胞內的cccDNA孵育活化，這是HBV復發的主要因素[7]。Ko等[8]也再次證實HBV基因組的細胞內循環以及病毒粒子感染細胞促進了cccDNA的形成。cccDNA在細胞核中的穩定性可能與泛素結合酶E2L3誘導載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基3A的蛋白酶體依賴性降解有關[9]，同時也可能與HBx蛋白穩定cccDNA的核定位有關[10]。由此可見HBV持續感染與cccDNA的不斷補充及其在細胞核中的穩定存在密切關系。

cccDNA的轉錄活動受到宿主細胞轉錄因子調控[7]，Zhang等[11]發現類視黃醇X受體α可直接與cccDNA結合，促進HBV復制，其潛在機制可能與促進cccDNA對乙酰轉移酶p300的招募有關；也有研究[12]發現肝細胞核因子可通過與cccDNA結合，促進其轉錄活動。另外，cccDNA結合組蛋白表觀遺傳修飾也可調控cccDNA轉錄，如cccDNA結合組蛋白乙酰化可使染色質結構松弛，從而激活轉錄活性，而去乙酰化則誘導染色質處于濃縮或非活性狀態[13]。除此之外，cccDNA轉錄活動也與HBx及HBcAg關系密切，如HBx蛋白與DNA損傷特異性結合蛋白1相互作用，通過降解Smc5/6蛋白，促進HBV轉錄[14]； Kinoshita等[15]也發現前體mRNA加工因子31與細胞核內的HBx相互作用，并通過HBx增強了cccDNA的形成；HBcAg的富精氨酸碳端域對HBV轉錄以及隨后的復制步驟起重要作用，可能與減少HBcAg與cccDNA的相互作用和減少與cccDNA結合的組蛋白乙酰化有關[16]。cccDNA的轉錄活動受到諸多因子調控，此處沒有一一羅列，而這些因子使cccDNA在細胞核持續存在，鑒于目前沒有靶向清除cccDNA的抗病毒藥物，這就使得徹底治愈慢性乙型肝炎變得異常艱難。

2 HBV顆粒與HBV持續感染

HBV顆粒包含HBV DNA顆粒、HBV RNA顆粒及亞病毒顆粒。HBV DNA顆粒即Dane顆粒由包膜和核衣殼組成。包膜由表面抗原組成；核衣殼由240個核心蛋白組成，其內包含HBV聚合酶和rcDNA，具有傳染性。HBV RNA顆粒與HBV DNA形態類似，兩者包膜和核衣殼組分相同，但RNA顆粒的核衣殼內是pgRNA，其是否具有傳染性，目前尚不清楚[17]；亞病毒顆粒呈絲狀或小球型，22 nm，僅由表面抗原組成，且數量遠遠超過了Dane顆粒，達10～10 000倍[18]。幾種病毒顆粒組成上的不同，使其在HBV持續感染中發揮不同的作用。

過量的亞病毒顆粒可作為HBV特異性體液免疫的誘餌，持續觸發抗原特異性T淋巴細胞受體信號通路而導致病毒特異性T淋巴細胞的衰竭；亞病毒顆粒也可以負調節先天免疫信號通路,如通過干擾c-Jun 氨基末端激酶激活，選擇性抑制Toll樣受體2配體，使單核細胞、巨噬細胞下調IL-12的表達[3,19]，這促進了HBV感染的慢性化。

pgRNA作為新的肝內HBV復制和治療反應的標志物，一項動物實驗[20]表明，在未抗病毒治療以前，血清中的pgRNA與肝細胞內的cccDNA顯著相關(r=0.89，P<0.000 1)，但治療以后，兩者無相關關系(r=0.13，P=0.733)，此項結果提示在未抗病毒治療以前，pgRNA可較準確反映HBV在體內復制情況。也有研究[17]表明在首次治療的慢性乙型肝炎患者血清中，HBV pgRNA顆粒顯著低于HBV DNA顆粒(P=0.007)，但給予核苷(酸)類似物抗病毒治療后，HBV pgRNA/HBV DNA顯著升高(P<0.000 1)，這可能與核苷(酸)類似物抑制HBV pgRNA逆轉錄有關。在停用核苷(酸)類似物抗病毒治療時，患者血清中若能檢測到HBV pgRNA顆粒，其在停藥后24周發生病毒反彈概率為100%。提示HBV pgRNA可能與HBV的持續感染和病毒反彈存在聯系。

3 HBV蛋白與HBV持續感染

3.1 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) HBV表達3個包膜蛋白，即小蛋白、中蛋白、大蛋白[21]。小蛋白含226個氨基酸，即HBsAg；中蛋白在小蛋白基礎上有一個額外的Pre-S2結構域，Pre-S2含55個氨基酸，其中包含人多聚白蛋白受體，HBV可通過多聚白蛋白受體與肝細胞間接結合，參與HBV感染肝細胞[22]；大蛋白在中蛋白基礎上有一個額外的Pre-S1結構域，Pre-S1含108或119個氨基酸，據不同基因型而定，其中第21～47位氨基酸殘基是肝細胞HBV受體的配體，對HBV感染肝細胞至關重要[23]。

HBsAg是HBV分泌到血清中的主要病毒蛋白，其定量價值是評價慢性HBV感染和抗病毒反應的重要標志。有研究[24]發現HBsAg中一些氨基酸替換可能損害病毒粒子的分泌，改變HBsAg與抗體結合的能力，或影響HBV復制，使得血清HBsAg、HBV DNA檢測水平下降；同樣，在宿主HBV免疫清除過程中，可能會誘導HBV Pre-S基因的許多位點發生突變，這些突變可能與HBV復制缺陷有關，可能是HBV發生免疫逃逸、隱匿性HBV感染的原因之一[23]。Bi等[21]也發現免疫突變株如N146Q、G145R等可使包膜蛋白S域的N端糖基化受損，從而影響病毒顆粒的分泌，且這些突變株可降低突變包膜蛋白對HBV抗體的親和力，從而導致診斷失敗、HBV隱匿性感染或疫苗接種失敗。此外，HBV S基因可整合到宿主啟動子序列和啟動子側翼調控序列中(整合位點：3q26、10q23、10q22、15p11.1、3p13、12q13)，通過宿主啟動子轉錄HBsAg，并從肝細胞釋放到外周血中，導致血清中HBsAg持續存在，甚至有時維持在較高水平[25]。而外周循環中的高水平HBsAg可引起樹突狀細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞功能受損，誘導宿主免疫耐受，從而導致HBV持續感染[26]。

3.2 乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg) HBcAg是一種結構蛋白，分子量為21 kD，包含183個氨基酸，前149個殘基組成N端域，對衣殼組裝至關重要；其余34個殘基形成一個富含精氨酸的C端域，與核酸結合，并發出核定位和輸出信號[27]。HBcAg在病毒復制中發揮著多種重要作用，包括衣殼組裝、pgRNA包裝、病毒逆轉錄以及病毒粒子分泌。MxA蛋白可抑制HBV mRNA的核質轉運以及在不影響HBcAg的情況下抑制HBsAg和HBV DNA產生[28]，而Fernandez等[29]研究發現HBcAg可與MxA啟動子相互作用而顯著下調MxA蛋白表達以影響其抗病毒作用。有研究[30]發現HBcAg可顯著抑制人類死亡受體5基因的啟動子活性，下調人類死亡受體5蛋白表達，使感染HBV的肝細胞對TNF相關的凋亡誘導配體誘導的凋亡不敏感，從而在慢性感染中發揮作用。樹突狀細胞是最有效的抗原呈遞細胞類型，具有獨特的能力，不僅能誘導對入侵病原體的初級免疫反應，還具有免疫耐受作用。Li等[31]發現HBcAg通過激活PI3K/AKT、ERK和P38信號通路，誘導樹突狀細胞上調CD274(又稱程序性死亡配體1或B7-H1)表達，促進樹突狀細胞凋亡，抑制HBV DNA的清除。而樹突狀細胞的減少有助于免疫耐受，這也可能是HBV持續感染的潛在機制之一。然而，也有報道[32]稱HBcAg通過PKC/NF-κB/bcl-2信號通路，促進DC2.4小鼠樹突狀細胞增殖和抑制其凋亡。鑒于HBcAg對免疫系統作用的復雜，更加深層次、全面的機制仍需進一步探討。

3.3 乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) Pre-C基因和C基因共同編碼HBeAg的前體，HBeAg前體通過蛋白水解過程去除氨基端的19個氨基酸殘基、羧基端的34個氨基酸疏水多肽，即形成HBeAg，有159個氨基酸殘基，分子量為18 kD[33]。HBeAg作為一種具有重要免疫調節作用的非結構性病毒蛋白，參與調節先天、適應性免疫反應和維持HBV的持續感染[34]。Lu等[35]發現HBeAg可以抑制組織細胞淋巴瘤細胞(U937細胞)的遷移，促進細胞因子產生，包括B淋巴細胞激活因子、IL-6和IL-10；HBeAg還可通過直接誘導方式促進人B淋巴母細胞活化和增殖。這些結果提示HBeAg在調節單核細胞功能和促進B淋巴細胞活化方面發揮一定作用。單核細胞和中性粒細胞的聚集對炎癥的發生至關重要，而Leu等[36]發現HBeAg可抑制人單核細胞和中性粒細胞的呼吸爆發和遷移，這可能會干擾隨后針對HBV的先天和適應性免疫反應，導致慢性感染的形成。除此之外，也有研究[33]表明HBeAg通過與Toll樣受體2、β干擾素TIR結構域銜接蛋白接相關受體分子的相互作用抑制先天性免疫的信號轉導；HBeAg可能促進HBeAg特異性和HBcAg特異性1型輔助性T淋巴細胞耗竭，并阻斷抗-HBc反應；HBeAg還可阻礙樹突狀細胞的成熟[37]。上述證據均提示HBeAg對HBV免疫治療有負作用，有利于維持HBV慢性感染。

3.4 DNA聚合酶 HBV DNA聚合酶(P蛋白)為含有832個氨基酸的多功能蛋白，含有多個功能區，從N端至C端依次為：末端蛋白域、間隔域、逆轉錄酶和核糖核酸酶域。末端蛋白域為嗜肝病毒所獨有的，包含合成負鏈的起始引物；間隔域是一個在P蛋白內保守性較差的區域，能夠承受各種缺失和插入，而不會顯著改變P蛋白基因組復制功能，逆轉錄酶和核糖核酸酶域負責逆轉錄和降解pgRNA[38]。P蛋白沒有3′-5′核酸外切酶活性，缺乏校對能力，病毒基因組復制的錯誤率高達10-7/個核苷酸，是其他DNA病毒的10倍，易導致突變株的出現。然而用于HBV治療的藥物核苷(酸)類似物都是以P蛋白的DNA聚合酶活性為靶點，這就使得治療過程中出現的HBV耐藥，成了影響長期治療的一個主要問題。末端蛋白域的8個突變株(rtL80I、rtD134N、rtN139K/T/H、rtY141F、rtM204I/V、rtF221Y、rtI224V及rtM309K)與病情進展顯著相關[39-40]。

3.5 HBx蛋白 HBx蛋白是一種非結構蛋白, 含154個氨基酸，分子量為17 kD。X蛋白對病毒復制的啟動和維持起著至關重要的作用，當沒有X蛋白表達時，幾乎檢測不到HBV的轉錄[41]。有研究[12]發現X蛋白在細胞核，通過招募P300/CBP相關因子，P300/CBP等組蛋白修飾物，調節cccDNA、激活HBV轉錄；在細胞質中刺激代謝、增殖等信號轉導通路，以促進病毒復制和轉錄；部分細胞質的X蛋白定位在線粒體的外膜，并與依賴電壓的陰離子通道相互作用，從而改變線粒體的膜電位，這可能與HBV誘導的肝損傷、肝癌的發生有關[14,42]；定位在內質網腔內的X蛋白與葡萄糖調節蛋白78直接作用，導致真核細胞起始因子2α磷酸化的抑制，抑制下游蛋白即活化轉錄因子4、DNA損害誘導基因153、Bcl-2蛋白表達，下調聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶和γH2AX蛋白水平，使感染HBV的肝細胞逃避內質網應激誘導的凋亡[43]。Jessica等[44]首次提出X蛋白可調節人類原代肝細胞內的Ca2+信號，并作為上游信號啟動X蛋白的其他效應，包括X蛋白調節細胞周期蛋白、刺激病毒復制。HBx作為HBV復制和HBV相關肝細胞癌變的重要輔激活劑，可以增強FoxA1與MSL2啟動子區結合的能力，上調的MSL2蛋白可通過泛素化APOBEC3B使其降解，來維持HBV cccDNA的穩定性，形成HBx/MSL2/cccDNA/HBV的正反饋回路，促進肝癌的發生[45]。而持續穩定的cccDNA水平與細胞內HBV基因再循環和繼發感染關系密切[8]。

4 小結

HBV可通過自身病毒成分之間的相互作用以及與宿主發生相互作用，維持cccDNA在細胞核的穩定性，促進HBV的復制，負向調節免疫功能，建立HBV慢性感染；HBV也可發生突變，產生免疫逃逸株、耐藥株等，降低對抗病毒藥物的敏感性。這些方面的因素均使得治愈乙型肝炎變得困難。幸運的是，一系列針對HBV持續感染藥物，從干擾和破壞病毒RNA、干擾病毒DNA蛋白合成、干擾HBsAg產生、激活人體免疫系統等方面都有了新的進展。希望能早日通過藥物試驗，盡早實現乙型肝炎的徹底治愈。