益氣養陰解毒方對胃癌前病變大鼠Th17/Treg平衡的影響

湯小芳 楊晴柔 陳芝蕓 何蓓暉 嚴茂祥#

1 桐鄉市第一人民醫院 浙江 嘉興 314505

2 浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江 杭州 310006

胃的癌前病變(PLGC)是正常胃黏膜發展到胃癌的重要階段，積極干預胃癌前病變是降低胃癌發生率的有效措施。近年研究發現，胃癌的發生發展與輔助性T細胞17（Th17）/調節性T細胞（Treg）平衡失調而引起腫瘤細胞發生免疫逃逸相關[1]。筆者在臨床上采用益氣健脾、滋肝補腎、清熱解毒為治療原則的“益氣養陰解毒方”治療慢性萎縮性胃炎伴腸化/異型增生取得較好療效[2-3]。為進一步探討其作用機制，本研究采用新生大鼠短期灌服致癌劑誘導胃癌前病變模型，并以Th17/Treg平衡為切入點，闡述益氣養陰解毒方防治胃癌前病變的免疫調節機理。

1 材料

1.1 動物：4～5周齡Sprague Dawley（SD）大鼠，雌性10只，雄性5只，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK（滬）2012-0002】；在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障環境中適應性喂養至2+月齡，以雌雄比2∶1進行配種，自由飲水采食，雌性大鼠懷孕后單籠喂養，選取出生3日的雄性乳鼠進行造模實驗。

1.2 藥物與試劑：益氣養陰解毒方由黃芪、黨參、熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮、白花蛇舌草、仙鶴草、莪術組成，按 2∶1.5∶2∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2.5∶2.5∶2.5∶1比例，由浙江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室制成流浸膏，每毫升含生藥2.565g。1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG）由東京化成工業株式會社提供；Bio-Plex EXP Rat Cyto Group Kit、Bio-Plex ProTMRat IL17A、IL-6、IL10 Standard、Bio-Plex ProTMRat TGF-β1 Standard由美國Bio-Red公司提供；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司提供；CHamQTM SYBRR qPCR Master Mix由南京諾唯贊生物科技有限公司提供；總蛋白提取試劑盒、BCA定量試劑盒由江蘇凱基生物技術股份有限公司提供。

1.3 主要儀器：Bio-Rad CFX Touch熒光定量PCR儀、Bio-Plex 200液相懸浮芯片系統，美國Bio-Red公司；Bertin Precellys-24生物樣品均質器為法國Bertin Technologies公司；Thermo Varioskan Flash全波長酶標儀，美國THERMO Electron公司。

2 方法

2.1 分組及處理：出生3d雄性乳鼠52只分為正常組14只，造模組38只。各乳鼠均與母鼠同養，常規母乳喂養，每日上午各乳鼠禁食2h后正常組灌胃生理鹽水、造模組灌服800μg/ml的MNNG，均0.1ml/只，連續10d；所有乳鼠于3周齡斷乳并分籠，常規自由飲食和飲水。以灌胃MNNG結束次日為觀察第1天，第22周末兩組各處理大鼠6只，空腹麻醉下處死，分離胃組織，沿胃大彎剖開，用生理鹽水沖洗，中性甲醛固定，HE染色觀察胃黏膜病理變化。剩余造模組24只大鼠隨機分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組8只，剩余正常組8只仍為正常組；第23周起，正常組、模型組每天灌服0.9%NaCl溶液10ml/kg，中藥高、低劑量組每天分別灌服25.65g/kg、8.55g/kg的益氣養陰解毒方流浸膏，均連續用藥12周后，按上述方法處理大鼠，收集胃組織標本，觀察胃黏膜肉眼變化，取胃竇至胃體長條組織在中性甲醛中固定用于病理觀察，其余胃組織-75℃待用。

2.2 檢測指標：胃黏膜病理學檢測采用HE染色，參考中國慢性胃炎共識（2012年，上海）[4]和異型增生病變Pavoda國際分級標準[5]，光鏡下觀察胃黏膜炎癥、萎縮、腸化、異型增生、腺瘤等情況。胃黏膜FoxP3mRNA、RORγt mRNA表達采用qRT-PCR法檢測，引物由生工生物工程(上海)有限公司設計合成，FoxP3上游引物：5'-ACT GCC AAG CAG ATC ACC TC-3’，下游引物：5'-CTG CAT AGC TCC CAG CTT CT-3’，擴增片段：122bp；RORγt上游引物：5'-GAG GCC ATT CAG TAC GTG GT-3’，下游引物：5'-CTG ACG AGG ACG ACT TCC AT-3’，擴增片段：116bp；β-actin上游引物：5'-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3’，下游引物：5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’，擴增片段：155bp。采用總蛋白提取試劑盒提取胃黏膜蛋白，以BCA法定量胃黏膜總蛋白濃度，采用液相懸浮芯片技術檢測血清和胃黏膜白介素-17（IL-17A）、白介素-6（IL-6）、轉化生長因子-β（TGF-β）、白介素-10（IL-10）等水平。

3 結果

3.1 益氣養陰解毒方對胃癌前病變大鼠胃黏膜病理影響：HE染色光鏡觀察發現，正常組大鼠胃黏膜上皮細胞完整，腺體排列整齊、規則，細胞核位于基底部。造模后22周末所有大鼠可見胃黏膜有淋巴細胞和漿細胞等炎細胞的浸潤，半數大鼠腺體略減少，排列稍紊亂，個別細胞腺體囊狀擴張，并出現輕度異型增生，所有大鼠胃黏膜腸上皮化生均不明顯；至造模后35周實驗結束，模型組大鼠胃黏膜炎細胞浸潤明顯，腺體排列紊亂加重，8例大鼠均有低或高級別異型增生，其中2例還可見高分化腺癌形成；仍未見明顯腸上皮化生。各藥物干預組大鼠胃黏膜也可見炎細胞浸潤，部分大鼠胃黏膜腺體稍減少，排列有紊亂，個別細胞腺體囊狀擴張及異型增生，以低級或不確定為主，見圖1。35周模型組大鼠胃黏膜炎癥、萎縮及異型增生等積分較正常組明顯增高（P＜0.05、P＜0.01），中藥低、高劑量組炎癥程度較模型組明顯降低（P＜0.05、P＜0.01），萎縮程度與模型組比差異無統計學意義（P＞0.05）；異型增生等程度較模型組明顯減輕（P＜0.05、P＜0.01）。見表1～表3。

圖1 大鼠胃黏膜病理（HE×100）

表1 各組大鼠胃黏膜炎癥程度比較（n=8,例）

表2 各組大鼠胃黏膜萎縮程度比較（n=8,例）

表3 各組大鼠胃黏膜癌前病變的比較（n=8,例）

3.2 益氣養陰解毒方對胃癌前病變大鼠胃黏膜RORγt、FoxP3mRNA表達的影響：模型組大鼠胃黏膜RORγtmRNA表達、RORγt/FoxP3比值較正常組顯著增強(P＜0.01)，FoxP3mRNA則與正常組比差異無統計學意義(P＞0.05)，中藥低、高劑量組RORγtmRNA表達、RORγt/FoxP3比值較模型組明顯下降（P＜0.01、P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠胃黏膜RORrt、FOXp3mRNA表達及比值（n=8）

圖3 各組大鼠血清IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10水平（n=8）

圖4 各組大鼠胃黏膜蛋白提取液IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10水平（n=8）

3.3 益氣養陰解毒方對胃癌前病變大鼠血清、胃黏膜IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β水平的影響：與正常組相比，模型組血清IL-17A、TGF-β和IL-6含量和胃黏膜IL-17A、TGF-β含量均顯著增高(P＜0.05、P＜0.01)；與模型組比，中藥高、低劑量組血清IL-17A、IL-6和TGF-β含量、胃黏膜IL-17A、TGF-β含量以及中藥高劑量組血清TGF-β含量明顯降低(P＜0.01、P＜0.05)。見圖3～圖4。

4 討論

胃黏膜萎縮伴腸上皮化生或異型增生屬于胃癌前病變。根據其臨床表現，可歸屬于中醫學“胃痛”“痞滿”等范疇；主要病機是脾胃虛弱、肝腎虧損、熱毒邪結。據此，筆者創立益氣養陰解毒方。方中黃芪、黨參補中益氣；熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮滋補肝腎；白花蛇舌草、仙鶴草、莪術清熱理氣解毒。諸藥共奏益氣健脾、滋肝補腎、清熱解毒之功。

本研究發現，益氣補腎解毒方能減輕炎癥細胞的浸潤，改善或逆轉大鼠胃黏膜異型增生，阻止胃癌前病變的進展，尤以高劑量效果明顯。與正常組相比，模型組大鼠 胃 黏 膜 RORγtmRNA表 達 上 調 、RORγtmRNA/FoxP3mRNA比值增高(P＜0.01)，血清和胃黏膜IL-17A和TGF-β水平以及胃黏膜IL-6水平均明顯增高(P＜0.01、P＜0.05)，提示新生大鼠短期灌服致癌劑MNNG誘導的胃癌前病變模型大鼠胃黏膜局部微環境發生了變化，促炎因子分泌增加，存在著Th17/Treg免疫失衡。益氣補腎解毒方干預后，大鼠胃黏膜組織RORγtmRNA表達下調、RORγt/FoxP3比值下降，血清和胃黏膜蛋白提取液IL-17A、TGF-β水平和胃黏膜蛋白提取液IL-6水平降低；表明通過調控RORγt、Foxp3等轉錄因子表達以及炎癥因子IL-17A、IL-6、TGF-β的水平，該方能一定程度糾正Th17/Treg失衡進而緩解減輕或逆轉胃黏膜炎癥及異型增生。